卵巢癌患者血清游离DNA的检测及其临床意义研究

摘要

目的：循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）是肿瘤细胞释放到血液中的单链或双联DNA，并携带原发瘤的基因突变信息。近年来，基于ctDNA的体液活检分析为肿瘤的分子诊断和病情检测方面带来了曙光。已有研究显示血清中循环DNA的水平在原发性肠癌、食道癌可能具有潜在标记物的作用。由于卵巢癌的早期检测还没有较好的指标，临床常见的卵巢癌一般处于中晚期。基于此，本研究主要探讨对ctDNA的浓度检测是否对卵巢癌患者的诊断和进展监测具有临床意义，同时与人附睾蛋白4（human epididymis protein4，HE4）的检测进行对比，并观察ctDNA联合HE4检测对卵巢癌诊断是否有潜在价值。
　　方法：采用病例和对照研究方法进行实验设计。本实验选取河北医科大学第二医院（24例）、河北医科大学第四医院（85例）、河北省人民医院（10例）卵巢癌119例，所有患者经手术治疗并经病理确诊；选取在河北省人民医院（53例）、河北医科大学第二医院进行健康体检（50例）者103例为对照。收集上述收纳的研究对象的血清，-80℃冻存。
　　首先利用正常人基因组DNA为标准品，将该标准品进行10倍系列稀释，然后以此为模板，利用Alu引物进行qPCR扩增，以DNA浓度的Log值为横坐标， Ct值为纵坐标绘制标准曲线。取-80℃冻存的血清200μL，抽提DNA并进行扩增，计算不同研究对象血清游离Alu115和Alu247 DNA的浓度及Alu247/115的比值。ELISA方法检测研究对象血清中 HE4的浓度。分别绘制受试者工作特性（ receiver-operating characteristic curve,ROC）曲线，分析检测指标的敏感性和特异性。
　　结果：
　　1.绘制人基因组DNA Alu115和Alu247 qPCR标准曲线
　　将购置的商品化人类基因组DNA进行10倍系列稀释（104~10-3 ng/mL），以此为模板，分别用Alu115和Alu247引物扩增，绘制以DNA浓度的Log值为横坐标、Ct值为纵坐标的标准曲线。
　　2.不同研究对象血清DNA绝对浓度和完整性指数
　　以不同研究对象血清DNA为模板，利用Alu115和Alu247引物扩增，根据标准曲线计算血清中Alu115 DNA浓度及Alu247/115的比值。
　　健康对照组：血清游离 DNA的绝对浓度（ Alu115）的中位数（ IQR25-75）为346.84（ IQR216.83-479.58） ng/ml；血清完整性指数（Alu247/115）的中位数（IQR25-75）为0.477（IQR0.424-0.505）。
　　卵巢癌组：血清游离DNA的绝对浓度（Alu115）的中位数（IQR25-75）为769.64(488.32-1035.30) ng/ml；血清完整性指数（Alu247/115）的中位数（IQR25-75）为0.646（0.529-0.828）。卵巢癌患者血清游离DNA浓度及DNA完整性指数均高于健康对照组（均P<0.01）。
　　3.血清Alu115和Alu247/115对卵巢癌诊断的价值
　　Alu115：ROC曲线下面积（area under the ROC curve, AUC）代表了卵巢癌与正常对照之间的差异。以Alu115检测值与对照组进行ROC评价，AUC为0.809（95％CI:0.750–0.868）；当ccf-DNA浓度为551.62时约登指数最大（0.590），将此数定为Cutoff（critical value，临界值）值，此时的敏感性为67.2%、特异性为90.3%、精确度为77.9%；阳性预测值为88.9%、阴性预测值为70.5%。
　　Alu247/115：以Alu247/115比值与对照组进行ROC评价，AUC为0.714（95%CI:0.648–0.780）；当Alu247/115比值为0.513时约登指数最大，将此数定为Cutoff值。此时的敏感性为73.1%、特异性为87.4%、精确度为79.7%；阳性预测值为87.0%、阴性预测值为73.8%。
　　4.血清HE4的定量检测
　　采用双抗体夹心ELISA方法分别检测了卵巢癌和对照组血清HE4。经ROC评价可见，AUC为0.806（95%CI:0.749-0.862）；Cutoff值或临界值为226.51pmol/L；敏感性为54.6%、特异性为94.2%、精确度为73.0%；阳性预测值为52.0%、阴性预测值为64.2%。
　　5.Alu115、Alu247/115与HE4的联合检测在卵巢癌诊断中的敏感性、特异性比较
　　表4显示，Alu115或Alu247/115与HE4的联合检测，比单独检测的特异性、敏感性和准确率均有提高。
　　结论：
　　1.卵巢癌血清游离Alu115DNA及Alu247/115显著高于健康对照人群，对卵巢癌诊断均具有潜在价值；
　　2.血清游离Alu115DNA及Alu247/115与卵巢癌患者年龄、临床分期、淋巴结转移具有相关性；
　　3.联合检测 Alu115DNA、Alu247/115HE4与HE4有利于卵巢癌的诊断。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 研究对象

2 实验材料

3 实验方法

结果

1 人基因组DNA标准品Alu115和Alu247 qPCR标准曲线

2 部分结果的实验室控制

3 不同浓度人基因组DNA标准品扩增曲线

4 不同研究对象血清DNA绝对浓度和完整性指数

5 血清游离Alu115DNA及Alu247/115与卵巢癌患者年龄、临床分期、淋巴结转移具有相关性

6 血清Alu115和Alu247/115对卵巢癌诊断的价值

7 血清HE4的定量检测

8 Alu115、Alu247/115与HE4的联合检测在卵巢癌诊断中的比较

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:循环肿瘤DNA在恶性肿瘤诊断意义的研究进展

致谢

个人简历