神经激肽（NK1、NK3）对基底核之纹状体神经元兴奋性毒性损伤的不同干预作用

摘要

中枢神经系统(CenterNervousSystem，CNS)退行性变性疾病的主要病理变化是病变区域神经元的大量死亡。亨廷顿氏病(Huntingtondisease，HD)是以新纹状体损害为主的锥体外系病，临床表现是不自主的肢体舞蹈样运动，伴有进行性的精神症状及智能衰退。是一种常染色体显性遗传的基底节和大脑皮质变性疾病，病理变化主要位于纹状体、大脑皮质和黑质。新纹状体中以中型中间神经元和纹状体向苍白球或黑质投射的有棘神经元的损害最为严重。以往研究表明在引起HD发生的多种因素中，谷氨酸兴奋性毒性是重要原因之一。但是目前对HD尚无有效的治疗，所以探索阻止谷氨酸兴奋性毒性损伤、保护纹状体神经元变性的新手段，对于完善HD治疗十分必要。 神经激肽(Neurokinins)是一个结构相似的速激肽家族，主要包括P物质(Neurokinin-1，NK1)、神经激肽A(NK2)、神经激肽B(NK3)，其生物学效应由相应的NK1、NK2和NK3受体(G蛋白偶联受体)来介导。研究表明神经激肽-神经激肽受体在基底核分布十分丰富，它们与基底核神经元之间存在显著的相互作用，PD病人和动物模型的基底核内神经激肽和受体下降。另外，本研究小组以往的研究发现神经激肽受体激动剂对MPTP(1-methyl-4-phenylpyridium-1,2,3,6-tetrahydropyridine，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶，)诱导PD动物运动症状具有显著影响。提示神经激肽-神经激肽受体参与了基底核生理和病理活动调节过程。Barker和Raffa等提出，神经激肽与神经元变性有关，内源性神经激肽的变化在神经变性疾病发生中可能起着重要作用。那么，神经激肽是否参与纹状体神经元兴奋性毒性损伤的调节过程呢?是需要进一步探讨的问题。该问题的阐明对于揭示神经变性疾病的发生机制及其治疗方法的选择具有重要的理论意义和实际意义。 本研究采用海人藻酸(Kainicacid,KA)兴奋性毒损伤模型、分别给予神经激肽NK1、NK3受体的特异性激动剂(senktide、septide)NK3的受体拮抗剂(SB218795)干预方法、Fluoro-JadeB染色、NADPH-d组织化学染色、免疫荧光双标记与激光共聚焦显微镜技术、动物行为学观察分析等方法，观察和分析了神经激肽(NKl、NK3)分子对纹状体神经元兴奋性毒性损伤和死亡的调节作用及其可能机制。结果如下： (1)KA诱导的纹状体神经元的损伤与谷氨酸的兴奋性毒性有密切的关系。我们发现海人藻酸损伤纹状体后大量的神经元变性死亡，其中大约有63.7％的变性细胞与谷氨酸受体亚基NR1双标记，大脑皮层100％的变性细胞与GluR2/3双标记。 (2)不同的神经激肽的受体激动剂起着不同的作用。NK1的特异性受体激动剂septide具有神经保护作用，可以减少神经元的变性死亡，NK3的特异性受体激动剂senktide具有加重KA引起的纹状体神经元的变性作用。6组FJB细胞数经KUSKUL-WALLIS秩和检验H值为137.71，有极显著的差异(P＜0.0001)；SNK两两比较在α=0.05水准下，KA+0.04μgsenktide组与KA+0.02μgsenktide组相比较无显著性差异，其余两组比较有显著性差异。Septide实验组相对增加NOS细胞的存活，senktide实验组减少存活的NOS细胞。通过比较6组注射侧与正常侧样本的差值，推断6组总体的差别，经完全随机设计的方差分析，6组比较F=81.47，有显著性差异(P＜0.001)；在a=0.05水准下，可以认为6组有显著性差异。SNK两两比较，在a=0.05水准下，KA+0.02μgsenktide试验组与KA+0.01μgsenktide试验组比较无显著性差异，生理盐水对照组与KA+septide组比较还不能认为有差别，其余任两组比较有显著性差异。 (3)药理拮抗实验发现NK3的特异性受体拮抗剂SB218795完全拮抗了NK3的特异性受体激动剂senktide的兴奋性毒性作用，对KA引起的纹状体神经元的损伤起到了潜在的保护作用，即相对减少了FJB阳性细胞。应用SAS软件进行统计，6组经KUSKUL-WALLIS秩和检验H值为120.74，差异极显著(P＜.0001)；SNK两两比较在α=0.05水准下，KA+senktide+SB218795组与KA+SB218795组，单纯SB218795组、DMSO组和生理盐水对照组比较无显著性差异，其余任两组比较都有显著性差异，存活的NOS细胞相对增加，通过比较6组注射侧与正常侧样本的差值，推断6组总体的差别，经完全随机设计的方差分析，6组比较F=30.77，差异极显著(P＜0.0001)；在α=0.05水准下，6组间有差别。SNK两两比较，在α=0.05水准下，KA+senktide+SB218795组与单纯海人藻酸组，海人藻酸组与KA+SB218795组，单纯SB218795组、DMSO组和生理盐水对照组比较还无显著性差异，其余任两组比较有显著性差异。 结论：(1)神经激肽分子可能通过调节谷氨酸-谷氨酸受体途径参与了基底神经核之纹状体神经元的兴奋性毒性损伤过程。 (2)不同神经激肽分子对神经细胞兴奋性毒性损伤具有不同作用，其中NK1具有保护作用，而NK3具有加重兴奋性毒性的作用。 (3)药理拮抗实验进一步证明NK3分子对兴奋性毒性的协同作用，提示NK3R特异性拮抗剂具有抵制兴奋性毒性损伤和保护神经元存活的潜在作用。本研究为神经激肽-受体信号参与基底核神经细胞退行性病变过程提供了新的实验数据，提示神经激肽NK1、NK3受体作为新的药物干预靶位，可能具有应用于基底核神经元保护的作用，对于治疗神经变性疾病HD、PD具有潜在价值。

目录

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英文缩略语及中文对照表

综述一 Fluoro-Jade特异性显示变性神经元技术及其在神经科学中的应用

综述二 神经元谷氨酸兴奋性毒性损伤与亨廷顿式病发生机制的研究进展

引言

第一部分 采用Fluoro-Jade B技术研究基底核和皮层神经元的兴奋性毒性变性死亡——Fluoro-Jade B染色及其与免疫荧光结合的双标记技术

第二部分 神经激肽NK1、NK3对KA诱导纹状体神经元兴奋性毒性变性死亡的不同作用----神经激肽特异性受体激动剂的动物干预实验

第三部分 神经激肽NK3加重KA诱导纹状体神经元兴奋性毒性损伤作用的进一步验证----神经激肽特异性受体拮抗剂的动物干预实验

小结

附图

个人简历

攻读硕士学位期间参加研究的课题：

攻读硕士期间发表的论文

致谢