棕点湍蛙抗微生物短肽的合成及其抗菌作用研究

摘要

棕点湍蛙抗微生物短肽是2006年河北师范大学刘敬泽教授从我国西南地区特产棕点湍蛙皮肤分泌液中分离提取的一类生物活性短肽,已经获得国家发明专利保护。为了克服分离提取生物活性短肽高成本的限制,探讨化学合成抗菌肽与天然活性产物的一致性,本文采用Fmoc固相法合成了2种棕点湍蛙抗微生物短肽,并对其抗菌活性进行了初步分析。
　　 目的：探讨棕点湍蛙抗微生物短肽的合成方法,对合成产物进行分析鉴定和抗菌效果评价。
　　 方法：
　　 1、棕点湍蛙抗微生物短肽的理化性质分析
　　 1.1短肽1
　　 单链多肽,分子量1706.96道尔顿,等电点位8.75。
　　 多肽全序列为:苯丙氨酸—亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸-脯氨酸-色氨酸-赖氨酸—谷氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-苏氨酸-苏氨酸。
　　 或表示为:Phe—Leu-Pro-Pro-Ser-Pro-Trp—Lys—Glu-Thr-Phe-Arg-Thr-Thr。简写为:FLPPSPWKGTFRTT。
　　 1.2短肽2
　　 单链多肽,分子量133.5.7道尔顿,等电点8.75。
　　 多肽全序列为:亮氨酸-亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-酰胺化。
　　 或表示为:Leu—Leu—Pro—Ile-Val-Gly-Lys-Leu—Leu—Ser-Gly—Leu—Leu—NH2。简写为:LLPIVGKLLSGLL-NH2
　　 2、合成和纯化方法设计
　　 采用Fmoc固相法,以Wang树脂为载体,从C端向N端依次进行保护氨基酸的缩合反应,经肽树脂裂解,RP-HPLC方法纯化合成产物。
　　 3、合成条件的优化
　　 3.1高效合成方法的选择
　　 分别采用手工合成和CS136XT型自动多肽合成仪方法,比较合成产物的产量和纯度,结合不同方法的合成规模、所需时间、原料利用、合成成本,优选高效合成方法。
　　 3.2 Wang树脂的溶胀时间的选择
　　 比较5—35min时65％DCM／DMF对Wang树脂的溶胀情况,以及不同溶胀时间树脂的Fmoc-Thr(oBt-)-OH偶联效率,优选Wang树脂的活化时间。
　　 3.3氨基酸树脂封闭的检测
　　 比较未乙酰化和乙酰化后的氨基酸树脂生成多肽的纯度,证明氨基酸树脂封闭对取得高纯度合成产物的必要性。
　　 3.4缩合剂的选择
　　 分别采用缩合剂HBTU和DCC合成短肽,比较不同缩合剂方法合成产物的氨基酸连接率、产量和纯度。
　　 3.5缩合反应时间的选择
　　 在加入氨基酸后0.5h到3h,Kziser法检测,优选氨基酸缩合反应的最佳时间。
　　 3.6缩合剂配比的选择
　　 分别采用氨基酸:HBTU:DIEA=1:0.9:2和氨基酸:HBTU:DIEA=1:1:l的配比,比较氨基酸的连接率和多肽产量。
　　 3.7反应溶剂的选择
　　 分别选用极性溶剂DMF、非极性溶剂DCM和混合溶剂65％DCM／DMF(v／v)为反应溶剂,比较氨基酸的连接率和产量。
　　 3.8氨基酸脱Fmoc保护试剂浓度和时间的选择
　　 采用不同浓度DMF／哌啶混合溶液,比较不同浓度和时间下的的哌啶溶液氨基酸脱保护的情况。
　　 3.9肽树脂裂解试剂的选择
　　 采用以下4种不同的裂解剂,优选合成短肽和树脂的裂解方式。
　　 A:TFA／phenol(v／v=95／5)；
　　 B:TFA／H2O(v／v=95／5)；
　　 C:TFA／H2O／EDT(v／v／v=95／2.5／2.5)；
　　 D:TFA／phenol／H2O／thioanisole／EDT(v／v／v／v=82.5／5／5／2.5)。
　　 4、短肽的批量合成
　　 通过合成工艺条件的优化,确定采用混合溶剂65％DCM／DMF(v／v)为氨基酸活化酯与树脂连接的介质,HBTL,为缩合剂,缩合配比为:氨基酸:HBTU:DIEA=1:0.9:2,反应时间为2h,CS136XT型自动多肽合成仪Fmoc固相合成棕点湍蛙抗微生物短肽。
　　 5、合成产物的纯化条件优化
　　 5.1有机相的选择
　　 RP-HPLC方法比较甲醇和乙腈两种不同有机相体系分离纯化多肽的分离度,综合成本、毒性等因素选择有机相。HPLC图谱求出峰时间,计算不同产物纯化的最佳出峰梯度(有机相最佳梯度)和线性梯度。
　　 5.2色谱柱的选择
　　 分别用C8和C18对多肽进行分离纯化,分析谱图的分离效果,选择最佳的色谱柱进行分离提纯。
　　 6、批量合成产物的纯化
　　 RP-HPLC方法,C18半制备柱型色谱柱,流动相水相为:水+0.1％TFA,有机相为:乙腈+0.1％TFA,线性洗脱,流动相流速为3ml／min,检测波长214nm。
　　 7、合成产物的分析和鉴定
　　 Kr00-5 C18分析型色谱柱,面积归一法计算合成产物的含量,对合成产物进行分析和鉴定。
　　 利用基质辅助激光吸收离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对合成产物进行分子量的确定,确定结构。
　　 8、合成产物的抗菌作用分析
　　 采用大肠埃希菌和会色葡萄球菌为实验菌种,分别测定合成抗菌肽,硫酸庆大霉素、青霉素、链霉素以及抗菌肽与三者分别联合使用的抑菌效果。
　　 结果：
　　 1、短肽合成条件的优化
　　 1.1高效合成方法的选择
　　 在投料为1gWang树脂(Sub=1.1mmol／g),氨基酸、缩合剂投料相同,反应介质相同的条件下,手工和CS136XT型自动多肽合成仪2种方法同时合成棕点湍蛙抗菌多肽。粗肽产量分别为0.14g、0.26g；纯度分别为:57.39％、67.94％。
　　 1.2 Wang树脂的活化
　　 Wang树脂在混合溶剂65％DCM／DMF(v／v)中30min以上溶胀完全,与Fmoc-Thr(oBt)-OH偶联效率较高。
　　 1.3不同缩合剂对氨基酸连接率的影响
　　 采用HBTU为缩合剂合成抗菌肽,氨基酸的连接率和未经纯化初步产物的纯度明显高于以DCC为缩合剂。
　　 1.4不同反应介质对氨基酸连接率的影响
　　 Fmoc固相法合成抗菌肽,混合溶剂65％DCM／DMF(v／v)为介质的氨基酸缩合反应,氨基酸的连接率明显高于单一的以极性溶剂DMF和非极性溶剂DCM为介质的反应。
　　 1.5时间因素对氨基酸缩合程度的影响
　　 Kziser法检测氨基酸与树脂的连接程度,不同氨基酸在抗菌肽的合成中时间达到2h均已充分反应。
　　 1.6缩合剂投料比对缩合反应的影响
　　 缩合剂采用HBTU,投料比为:氨基酸:HBTU:DIEA=1:0.9:2时,氨基酸缩合反应时间短、连接率高。
　　 1.7对未反应氨基的乙酰化
　　 每次在氨基酸缩合反应完全后,对未反应的氨基进行乙酰化,与未封闭系统比较,可明显提高合成粗肽的纯度。
　　 1.8脱保护试剂的浓度和时间
　　 脱保护试剂为20％哌啶／DMF混合溶液,脱保护时间为20分钟／每次,脱保护效率可达到99％。
　　 1.9切割试剂的效果
　　 本实验采用的切割试剂TFA／phenol／H2O／thioanisole／EDT(v／v／v／v=82.5／5／5／2.5)切割后的树脂是原来的20％,用乙醚处理滤液无白色物质生成,说明切割相对彻底。
　　 2、抗微生物短肽纯化的优化
　　 2.1不同有机体系对纯化效果的影响
　　 采用C18分析型色谱柱分离纯化抗菌肽,经RP-HPLC图谱分析,有机相为甲醇时,抗菌肽保留时间短,与杂峰接近,不便于提纯；而有机相为乙腈时,抗菌肽保留时间在13min到19min之间,距离杂峰较远,便于提纯。
　　 2.2不同色谱柱对纯化效果的影响
　　 采用乙腈为有机相,经RP-HPLC图谱分析,用C8分析型色谱柱,未经纯化的抗菌肽的主峰和杂峰不易分开,且有较大的拖尾峰；用C18分析型色谱柱,未经纯化的抗菌肽的主峰和杂峰能很好的分离,且没有拖尾峰。
　　 3、人工合成抗微生物短肽的抗菌活性分析
　　 合成抗菌肽对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠埃希氏菌均有一定的杀菌作用,MBC值分别为200μg／ml和100μg／m。合成抗菌肽与青霉素、链霉素联合使用后抗菌作用增强,其中与青霉素联合使用的效果明显,对金黄色葡萄球菌的MBC值达到青霉素／合成肽0.625／251μg／ml。合成肽显著提高了经典抗生素的杀菌作用。
　　 结论：
　　 1.经工艺优化,棕点湍蛙抗微生物短肽最佳的合成工艺为:Fmoc固相合成,利用CS136XT型多肽合成仪,Wang树脂为固相载体,65％DCM／DMF(v／v)为反应溶剂,HBTU为缩合剂,单个氨基酸反应时间为2h。确定基本纯化条件为:采用C18型色谱柱,流动相A:水+0.1％TFA,流动相B:纯乙腈+0.1％TFA,线性梯度洗脱,流动相流速为1ml／min,检测波长214nm。本课题采用的Fmoc固相合成棕点湍蛙抗微生物短肽反应条件温和,重复性好,产物纯度高,MS检测分子量与预期相符。
　　 2.人工合成棕点湍蛙抗微生物短肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用弱于生物化学方法提取的天然棕点湍蛙抗微生物短肽,提示人工合成抗菌肽与天然产物之间空间结构可能发生了改变,人工合成的棕点湍蛙抗菌肽尚需在构效关系分析基础上进行进一步的结构改造设计。
　　 3.利用抗菌肽与传统的经典抗生素不同的抑菌作用机理,合成抗菌肽与传统的经典抗生素青霉素、链霉素的联合应用可显著提高经典抗生素的杀菌作用强度,有助于改善病原性细菌对传统抗生素的耐药性。

目录

文摘

英文文摘

绪论

1 细菌耐药性的现状分析

2 抗菌肽的研究进展

3 棕点湍蛙抗微生物肽的研究进展

4 抗菌肽研究目前存在的主要问题

5 本项目研究的主要内容

第一部分 棕点湍蛙抗微生物短肽固相合成

1 实验材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器设备

2 合成路线

2.1 合成化合物及其结构

2.2 合成路线

2.3 多肽合成实验装置图

3 合成实验步骤

3.1 化合物1人工合成

3.2 化合物1仪器合成

3.3 化合物2人工合成

3.4 化合物2仪器合成

3.5 合成条件优化选择

3.6 多肽批量合成

4 结果与讨论

4.1 高效合成方法的选择

4.2 树脂的活化

4.3 氨基酸树脂是否封闭对氨基酸纯度的影响

4.4 缩合剂的选择对氨基酸连接率的影响

4.5 缩合试剂配比的选择对氨基酸连接率的影响

4.6 时间对氨基酸缩合反应的影响

4.7 反应溶剂对氨基酸连接率的影响

4.8 脱保护试剂的浓度和时间的选择

4.9 裂解试剂的选择

第二部分 棕点湍蛙抗微生物短肽的纯化

1 实验部分

1.1 实验仪器

1.2 实验试剂

2 合成产物纯化条件的选择

2.1 不同有机相体系纯化的选择

2.2 合成产物线性梯度的测定

2.3 产物线性洗脱时间的确定

2.4 色谱柱的选择

3 结果和讨论

3.1 不同有机相体系对纯化效果的影响

3.2 不同色谱柱对分离效果的影响

3.3 多肽的批量分离纯化

3.4 合成产物的RP-HPLC,MS分析鉴定

第三部分 人工合成抗微生物短肽的抗菌活性分析

1 实验材料

1.1 受试药品

1.2 细菌菌株

1.3 主要试剂

1.4 仪器设备

2 方法

2.1 培养基的配制

2.2 棕点湍蛙抗微生物短肽1和各药液的配制

2.3 增菌和实验菌的配制

2.4 受试药物对各实验菌株的MBC的测定

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢