中华鳖两株气单胞菌外膜蛋白及IL-8的克隆与表达

摘要

中华鳖(Chinese sofishell turtle,Pelodiscus sinensis or Trionyx sinensis)是我国的重要经济型水产,其鲜美的肉质和丰富的营养广受国内外消费者的青睐。但近几年中华鳖病原性疾病大量爆发,给我国养鳖业造成了重大损失。因此,中华鳖病原性疾病的预防和冶疗成为我国养鳖业的首要问题。
　　本课题从特异性免疫和非特异性免疫两方面对中华鳖病原性疾病的防治进行探索性研究。特异性免疫方面从中华鳖致病菌嗜水气单胞菌HBNUAh01和维隆气单胞菌HBJY01中分别克隆外膜蛋白A基因并分别于烟草叶片细胞中进行表达和检测。分别以嗜水气单胞菌HBNUAh01和维隆气单胞菌HBJY01为模板进行嗜水气单胞菌外膜蛋白A(AhompA)和维隆气单胞菌外膜蛋白AⅡ(AvompAⅡ)基因片段的PCR扩增,并将其分别克隆到pEASY-Blunt Simple载体中以进行测序。测序正确的AhompA和AvompAⅡ基因序列分别与含有黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)基因的表达载体pCAMBIA1300构建重组表达质粒。将重组表达质粒转化到农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受态细胞中,随后用阳性转化子转染烟草叶片细胞。使用激光扫描共聚焦成像系统(Confocal Laser Scanning Microscope)分别检测观察融合表达AhompA和AvompAⅡ基因的黄色荧光蛋白并采用RT-PCR检测AhompA和AvompAⅡ基因在烟草叶片中的转录情况。最终从嗜水气单胞菌HBNUAh01中克隆出大小为1032bp的AhompA基因序列,从维隆气单胞菌HBJY0l中克隆出大小为996bp的AvompAⅡ基因序列,并在烟草叶片中分别成功表达AhompA和AvompAⅡ与YFP的融合蛋白。AhompA和AvompAⅡ基因在烟草叶片细胞中的成功表达为进一步研究利用植物疫苗防治嗜水气单胞菌和维隆气单胞菌引起的水产动物疾病奠定了基础。
　　非特异性免疫方面从中华鳖肝脏组织中分别克隆出中华鳖白介素8成熟肽(Psil-8(m))与中华鳖白介素8前体肽(Psil-8)基因并分别于大肠杆菌表达系统中进行表达,并于检测纯化后对中华鳖中性粒细胞进行趋化性实验以验证蛋白功能活性。利用信号肽预测软件Signal P3.0对中华鳖白介素8蛋白序列(ACCESSION:ACP28490)进行信号肽定位分析,根据信号肽分析结果设计特异性引物分别从中华鳖肝脏组织中扩增出Psil-8(m)和Psil-8基因片段。并将其分别克隆到pMD19-T Simple载体中以进行测序。测序正确的Psil-8(m)和Psil-8基因分别与表达载体pET-25b构建重组表达质粒。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受念细胞中,经SDS-PAGE分析IPTG诱导阳性转化子表达情况后,使用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白并进行Western Blot检测。随后将纯化后的蛋白用于对中华鳖中性粒细胞的趋化性实验以检测其活性。最终从中华鳖肝脏组织中克隆出大小为246bp的Psil-8(m)基因片段和大小为312bp的Psil-8基因片段,并在大肠杆菌BL21(DE3)@成功表达Psil-8(m)和Psil-8目的蛋白,纯化后的Psil-8(m)和Psil-8在浓度为0.9-1.35μg/μL范围内对中华鳖中性粒细胞的趋化指数最高,其中Psil-8(m)最高趋化指数为3.710,Psil-8最高趋化指数为2.634,且二者趋化指数均在浓度小于0.9μg/μL大于1.35μg/μL时呈递减趋势。Psil-8(m)和Psil-8的成功表达及其趋化活性的成功检测,从非特异性免疫方面为防治中华鳖病原性疾病奠定了基础。