鸽Ⅰ型副粘病毒致病性和神经嗜性研究及反向遗传系统的构建

摘要

随着生活水平的提高，鸽养殖户越来越多，养殖规模越来越大。肉鸽有很高的食用价值，信鸽具备赏玩价值。鸽源Ⅰ型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus type I, PPMV-1），又称为鸽源新城疫病毒（Pigeon Newcastle Disease Virus），是鸽类主要烈性传染疫病之一，有极高的致病率和致死率，严重危害养殖业的经济利益。而且PPMV-1在鸡中传代后致病力明显增强，造成大流行的风险显著提高。 PPMV-1绝大多数为基因Ⅵ型，有很强的宿主特异性。但是目前缺少专门针对PPMV-1的商品化的疫苗，养殖户一般使用的是鸡新城疫疫苗，虽然和PPMV-1有一定的交叉保护力，但是免疫效果不佳。此外，PPMV-1患鸽一般都不予治疗，而是采取捕杀、焚烧处理，给养殖户造成很大的损失。本研究以研制疫苗和寻找对症治疗靶点为出发点，进行了毒株的全基因组序列测序、致病力分析、噬神经性分析以及病毒的反向遗传学毒力相关位点的研究。 为了确定该病毒的基因组特性和致病力，以便研究出对抗该病毒的疫苗和对症治疗的药物，降低该病毒给养殖业造成的损失，本研究用2015年分离自北京的一株PPMV-1毒株，进行全基因组测序，并对其进行分析发现该分离株基因组全长为15192nt，F基因裂解位点为112RRQKRF117，符合强毒裂解位点。通过对F基因系统进化分析得出，这些分离株属于class II基因VIb型，和国内发现的绝大多数PPMV-1一致。随后，我们进行了动物感染实验，用36只1月龄健康肉鸽，随机分为攻毒组、对照组和同居感染组，攻毒组分自然感染（滴鼻组和点眼组）和人工感染（静脉注射组、肌肉注射组）不同途径感染，每组6只。攻毒后对其临床症状、体重变化、排毒模式、组织病理变化进行分析。结果表明不同感染途径致病率有较显著差异，但是几乎都有转脖、精神沉郁等神经症状。组织病理学分析显示感染后的鸽肺部出血、肠、肝出血，脑出血伴脑水肿，推断该毒株可能是嗜内脏和嗜神经混合型。 为了进一步确定该毒株的嗜神经性，我们从7日龄鸽胚中分离了鸽原代神经细胞，用不同MOI（multiplicity of infection，感染复数）的PPMV-1进行感染，并用荧光标记病毒和神经细胞，发现病毒能进入神经细胞，随后我们检测了感染不同时期细胞的TCID50，其TCID50值随感染时间而增加，表明此病毒能在细胞内复制。此外，我们还通过形态学和流式细胞术检测了被感染神经细胞的凋亡，结果发现病毒浓度越高，细胞凋亡越严重。此结果表明，该毒株能感染神经细胞，从而引起神经症状，为对症治疗药物的研制提供理论依据。 反向遗传学操作技术可以对病毒基因组进行缺失、突变或外源基因插入、修饰等，快速获得毒力致弱毒株，从而为研制专门针对PPMV-1的疫苗提供靶点。我们把该毒株的全基因组DNA克隆至pBSK载体，P、L、NP分别转至pCNA3.1载体作为辅助质粒，四个质粒共转染BSR-T7/5细胞，成功拯救出了PPMV-1。 之前的研究表明，虽然PPMV-1对鸽的致病率和致死率都很高，但是对鸡却不产生明显的症状。HN蛋白是新城疫病毒的膜蛋白，在宿主病毒感染中起关键作用，包括受体结合、神经氨酸酶和融合促进活动。因此，HN蛋白一直是疫苗设计的目标。据此我们比较了鸡和鸽HN蛋白的保守位点，有以下几个不同：32（L/SL），49（G/EG），60（SP/S），75（S/GS），102（I/TVI），112（Y/H），122（G/R），147（D/G），151（F/FY），156（F/Y），182（AT/A），197（R/RI），263（K/NK）266（ITAV/T），290（V/TV），293（K/KER）304（SG/G），310（D/NG），347（EG/GE），384（EK/E），432（NS/YN），464（SP/PS），479（HY/YH）。用SPD viewer软件分析发现，这些位点都位于蛋白质二级结构无规则卷曲上，而无规则卷曲经常构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。

目录

声明

引言

文献综述

1. 1 PPMV-1概述

1.2 NDV的流行情况

1.3 NDV致病力评价

1.4 PPMV-1的致病机制

1.5 HN蛋白的结构和功能

1.6 HN蛋白毒力相关位点

1.7细胞凋亡的形态学与生物化学特征的改变及其机制

2 PPMV-1系统进化分析及全基因组测定

2.1材料

2.2 方法

2.3结果与分析

2.4 小结

3 PPMV-1致病力分析

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.4 小结

4 PPMV-1在鸽神经细胞中的复制及诱导产生的神经病变

4.1材料

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4小结

5 PPMV-1反向遗传系统的建立

5.1材料

5.2实验方法

5.3实验结果

5.4小结

讨论

附录

参考文献

研究成果

致谢