雷氏大疣蛛毒素对荷瘤裸鼠神经胶质瘤免疫治疗的影响

摘要

目的：雷氏大疣蛛（macrothele raven）主要分布于我国的广西，云南，四川及越南的东南亚雨林等地，体型较小，主要捕食各种鳞翅目的成虫，蟋蟀，蝗虫等，除觅食外，很少出洞活动。雷氏大疣蛛毒素-Ⅰ（MaTx-Ⅰ）是分离自雷氏大疣蛛粗毒毒液中分离纯化出来的一种神经毒素，能够抑制神经胶质细胞生长。恶性神经胶质瘤是Ⅳ级胶质瘤，是成人中最致命的原发性神经胶质瘤。且神经胶质瘤患者的存活率较差，常规的治疗，包括手术以及化疗和放疗，明显改善了神经胶质瘤，但接受了包括手术切除、化疗和放疗在内的常规治疗的患者的生存时间约为15个月，仅有10%的患者生活在5年以上。因此，需要更有效的方法来治疗神经胶质瘤。本实验探讨MaTx-Ⅰ对神经胶质瘤荷瘤裸鼠肿瘤的影响及其机制。 方法：首先用脉冲电流刺激雷氏大疣蛛使其射出毒液，经过快速蛋白液相色谱分离再经过阳离子交换色谱，硅胶柱层析，制备正相薄层色谱纯化，经过检测鉴定出的一种小分子量的重要单一组分。经MALDI-Tof MS质谱分析其分子质量。 用梯度密度离心法分离小鼠骨髓白膜层细胞加入rmIL-4和rmGM-CSF刺激培养DC细胞，然后与小鼠脾淋巴细胞共培养；用CKK8法检测检测LPS、MaTx-Ⅰ对DC与淋巴细胞共培养活性的影响；ELISA检测经LPS和MaTx-Ⅰ刺激DC与淋巴细胞共培养中细胞上清液中IL-4、INF-γ浓度；流式细胞术检测MaTx-Ⅰ对经LPS刺激DC与淋巴细胞共培养中Th1、Th2比例。 将U87神经胶质瘤接种于裸鼠皮下，观察成瘤情况。待裸鼠皮下成瘤后将荷瘤裸鼠分成四组生理盐水组、MaTx-Ⅰ组、免疫细胞组、MaTx-Ⅰ+免疫细胞组，加药治疗荷瘤裸鼠，21天后，用眼眶取血的方法采取各组小鼠的外周血，用ELISA的方法检测外周血血清中各免疫因子的含量。解剖出各组裸鼠皮下肿瘤，用电子分析天平称瘤重，用倒置荧光显微镜观察并测量肿瘤长径和短径，计算瘤体积和抑瘤率。 结果：将雷氏大疣蛛粗毒快速蛋白液相色谱分离再经过阳离子交换色谱，硅胶柱层析，制备正相薄层色谱纯化分离得到一种新型神经毒素命名为MaTx-Ⅰ，通过MALDI-Tof MS质谱分析MaTx-Ⅰ的相对分子质量为4.3 kD。 MaTx-Ⅰ在浓度为10μg/mL时刺激DC与淋巴细胞共培养的细胞活性最高、LPS在浓度为1μg/mL刺激DC与淋巴细胞共培养的细胞活性最高，MaTx-Ⅰ能上调Th1/Th2比例、Th1百分率（P＜0.05），IFN-γ浓度（P＜0.01），下调IL-4浓度（P＜0.05）；对Th2百分率无影响(P＞0.05)。 在接种肿瘤后，一周左右可以看到肿瘤长出，在荷瘤裸鼠分组给药21天后，MaTx-Ⅰ+免疫细胞组的荷瘤裸鼠静脉血清中各免疫因子的含量都有显著的增加。生理盐水组的荷瘤裸鼠的瘤体积达到312.57±47.76 mm3、MaTx-Ⅰ组的荷瘤裸鼠的瘤体积达到270.44±22.53 mm3，免疫细胞组的荷瘤裸鼠的瘤体积达到114.86±10.62 mm3，与MaTx-Ⅰ组相比没有显著差异（P>0.05）， MaTx-Ⅰ+免疫细胞组的荷瘤裸鼠的肿瘤增长受到明显抑制，在给药第21天荷瘤裸鼠的瘤体积达到60.47±4.17 mm3(P＜0.05)；在给药第21天生理盐水组的瘤重达到2.92±0.65 g，MaTx-Ⅰ组的瘤重达到2.03±0.48 g，免疫细胞组的瘤重达到1.78±0.15 g，MaTx-Ⅰ+免疫细胞组荷瘤裸鼠的肿瘤增长受到明显抑制，瘤重为0.61±0.06 g，与MaTx-Ⅰ组及免疫细胞组相比均有显著差异（P<0.05）。MaTx-Ⅰ+免疫细胞组的抑瘤率为79.11%。 结论：MaTx-Ⅰ能够通过调节免疫重建荷瘤裸鼠的T细胞的分化来抑制肿瘤的增殖，为MaTx-Ⅰ在神经胶质瘤的临床应用方面奠定了理论基础。

目录

声明

前言

文献综述

1. 蜘蛛毒素的药用价值

2. 神经胶质瘤的治疗策略

第一章 雷氏大疣蛛毒素分离纯化的优化

1. 引言

2.实验仪器与试剂

3. 实验方法

4. 实验结果

5. 讨论

第二章 MaTx-I对成熟树突细胞诱导T细胞分化的免疫调节的影响

1 引言

2 实验仪器与试剂

3 实验方法

4实验结果

5 讨论

第三章 MaTx-I对免疫重建荷瘤裸鼠肿瘤增殖的影响

1 引言

2 实验仪器与试剂

3 实验方法

4实验结果

5 讨论

结论

参考文献

致谢

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