烟草果胶生物降解及应用技术研究

摘要

果胶质是烟草等植物细胞壁的构成成分，是结构复杂分子量大的复合糖类化合物。果胶在烟草中的含量约为5％-13%。烟草中果胶质含量过高使得烟草燃烧不充分，分解成小分子甲醇、乙酸等使卷烟吸味刺激性大。本课题利用从烟田土壤中自行筛选的产果胶酶的微生物来降解烟草薄片制造工序中的果胶质，首先对微生物产酶条件与降解条件进行了优化，并分别对果胶质酶解后的理化性质与酶纯化、酶特性进行研究，最后以毕赤酵母为表达载体建立聚半乳糖醛酸酶(PG)基因工程菌，并大规模施加于薄片制备工艺过程中，从而减少薄片中的果胶质含量。本研究为果胶酶工业化应用于薄片制造工艺提供了依据。
　　研究通过透明圈初筛与摇瓶复筛法筛选出两株高产果胶酶的真菌，分别命名为sw06和sw09，经 ITS序列测定及系统发育分析鉴定为黑曲霉与微紫青霉。以发酵罐培养，确定最佳培养周期分别为48h与72h。采用响应面法优化黑曲霉(Aspergillus niger) sw06最佳发酵工艺参数为：果糖48.90g/L，蛋白胨5.00g/L，果胶粉6.00g/L。此条件下，酶活力理论上可达4198.45U/mL，验证实验检测值为(4175.65±21)U/mL，与初始发酵培养基相比，酶活力提高1.6倍；采用正交试验方案设计优化微紫青霉(Penicillium janthinellum)sw09最佳发酵工艺参数为：葡萄糖50g/L，酵母浸粉3g/L，KH2PO41g/L，果胶粉2g/L。其中碳源及诱导底物对酶活力影响极显著。
　　粗果胶酶通过硫酸铵沉淀、Sepharose CL-6B分子筛柱层析以及DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析三次分离纯化，得到果胶酶的主要组分（经鉴定为PG），结果表明：黑曲霉产果胶酶单一组分分子质量为66.2kD。果胶粗酶最适pH值为5.0，最佳反应温度为55℃。pH稳定范围为3.0～5.0，仍保持90%以上酶活力。酶的热稳定性为50℃以下，2h以后仍能保持56.7%酶活，温度升高，酶的热稳定性下降。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程，米氏常数Km=(0.50±0.01)mg/mL，最大反应速率Vmax=(5000.00±0.02)μg/(mL·min)。微紫青霉产果胶酶单一组分分子质量为66.2kD。粗酶最适pH值为5.0，最佳反应温度为45℃。pH稳定范围为4.0～6.0，酶的热稳定性为50℃以下。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程，米氏常数Km=(1.67±0.03)mg/mL，最大反应速率Vmax=(3333.33±0.02)μg/(mL·min)。
　　分别以二级解纤纯梗、二号挤干机出口梗末、高浓混合浆三个试验点为考察对象，测定以不同条件下的粗酶液降解三个试验点的果胶降解率。实验结果显示，以微紫青霉产出的粗酶液酶解二级解纤纯梗降解效果最好，在料液比1:5、反应温度50℃、处理时间2h的条件下，果胶质含量从3.07%下降到1.81%，降解率达到41.35%。
　　分别以最优酶解条件下酶解二级解纤纯梗，再提取酶解前后二级解纤纯梗中的果胶质，由红外光谱分析可以看出，解纤梗中果胶多糖分子主链为α-糖苷键连接，酶解前后其基本结构官能团并未发生明显改变。由GC-MS单糖组分分析可知，果胶质基本结构多以半乳糖醛酸单体形式存在，葡萄糖含量其次，成分的组成、含量因酶解发生了明显的变化，原解纤梗果胶中半乳糖醛酸含量为39.89%，经黑曲霉酶解后降低至19.71%，青霉酶解后降低至28.08%，说明部分果胶已降解。凝胶过滤法测定表明，果胶质经微紫青霉酶解后，相对分子量由341KDa降低至55KDa。SEC-MALLS测定果胶质的绝对分子量，从均方根半径与重均分子量的双对数曲线中判定果胶分子在水溶液中的构象。果胶分子主要以球形存在，经微紫青霉酶解后，分子形态出现直链型，说明酶促反应破坏其球形构象打开成直链型；重均分子量(Mw)也从3.227×105g/mol减小至7.526×104g/mol，这与凝胶法结论相符。由热重分析表明，果胶质经黑曲霉酶解后，残重从24.46%下降到9.84%，燃烧更为充分。热裂解分析可知解纤梗酶解后挥发性乙酸从(9.07±0.15)%减少到(8.31±0.12)%，氮杂环类物质含量由(5.06±0.03)%降低至(3.97±0.05)%，感官评价表明酶解后的解纤梗添加于卷烟中刺激性减轻，香气量增加，香气质有所改善，香味更加丰富，但因羰基化合物减少使得劲头不足。
　　从A.niger sw09中提取聚半乳糖醛酸酶(PG)基因，构建重组表达质粒pPICZαA，转化毕赤酵母 X33构建一株基因工程菌 X33/pPICZαA-PG。转化子基因组片段大小为1608bp。将此基因组片段扩增回收，序列测定表明PG基因已经成功地插入毕赤酵母表达载体。阳性克隆蛋白经SDS检测分子量为60KDa左右，可能是由于糖基化的影响，使目的蛋白的分子量比理论值41KDa偏高。重组菌株产酶周期为36h，粗酶活力为2872.91U/mL。融合蛋白经过镍琼脂糖亲和层析法进行纯化，经检测为一条清晰带，重组蛋白质浓度测定为8.1μg/μL。在线研究结果表明，在工艺生产线上的抄造浆中添加重组酵母生产的聚半乳糖醛酸酶降解果胶质效果良好，以8‰的添加量为最优，抄造浆果胶由3.65%减少到3.01%，降解率达到17.53%。

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第一章 绪论

1.1选题背景

1.2果胶质的研究现状

1.3果胶酶的研究现状

1.4烟梗原料利用研究现状

1.5烟梗果胶质降解研究现状

1.6课题研究内容和意义

1.7工艺流程和技术路线

第二章 烟草果胶质降解菌的筛选、鉴定及形态观察

2.1材料与仪器设备

2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.4本章小结

第三章优选菌株产胞外果胶酶的液体培养条件优化

3.1材料、试剂与仪器

3.2实验方法

3.3结果与讨论

3.4本章小结

第四章酶的纯化及酶特性研究

4.1材料与仪器设备

4.2实验方法

4.3结果与讨论

4.4本章小结

第五章 薄片生产线中果胶质生物降解条件优化

5.1材料与仪器设备

5.2实验方法

5.3结果与讨论

5.4本章小结

第六章解纤梗果胶质降解理化性质研究

6.1 材料与仪器设备

6.2实验方法

6.3结果与讨论

6.4本章小结

第七章基因工程菌构建及应用

7.1材料与仪器设备

7.2实验方法

7.3结果与讨论

7.4本章小结

第八章结论与展望

8.1结论

8.2展望

致谢

参考文献

附录1 攻读硕士学位期间发表论文目录

附录2 黑曲霉sw06基因序列及Genbank登录号

附录3 微紫青霉sw09基因序列及Genbank登录号

附录4 黑曲霉sw09 PG酶基因序列及氨基酸序列