毛白杨雄株花粉败育细胞学观察和双抗虫基因转化的研究

摘要

通过基因工程培育抗虫且对环境安全的杨树新品种,已经成为杨树抗虫基因工程研究的主要方面.为避免雌株飞絮,雄株花粉漂移携带外源基因转移等环境问题,该研究确定了以毛白杨败育雄株为双价抗虫基因遗传转化工程体.在对其进行花粉败育形态学和细胞组织学研究基础上,通过农杆菌介导法对其进行双抗虫基因(Bt基因和API基因)的转化,并对筛选获得的卡那霉素抗性植株进行分子生物学检测和抗虫性鉴定.主要研究结果如下:1)毛白杨雄株花药外部形态及花粉发育过程连续两年实验数据表明:从花药发育的外部形态观察,在花药发育的过程中没有观察到散粉现象;从花粉发育的细胞组织学观察,其花粉败育的原因可能是绒毡层细胞解体延迟导致小孢子发育受阻,不能形成正常成熟的花粉粒.由此确定该毛白杨雄株为雄性不育.2)建立了毛白杨雄株遗传转化再生体系.确定其转化时所用的诱导芽分化培养基为:MS+TDZ0.1mg/L+IAA0.1mg/L附加蔗糖3％、琼脂0.6%;转化芽增殖培养基为:MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.1mg/L附加蔗糖3%、琼脂0.6%;生根培养基为:1/2MS+IBA0.5mg/L附加蔗糖1.5%、琼脂0.6%.3)通过农杆菌介导法对258个叶片外植体进行双抗虫基因的转化,其中分化数为81个,共得到108个转化芽.将所得的转化芽经卡那霉素抗性筛选,共得到21株卡那抗性植株,将部分卡那抗性苗经PCR检测,阳性率为90%,3株阳性植株经Southern杂交分析,证明外源Bt基因已整合到杨树基因组DNA中.4)用转基因毛白杨雄株的幼嫩叶片喂养杨扇舟蛾和舞毒蛾幼虫,虫试结果表明,转基因毛白杨雄株对幼虫的毒性明显大于对照未转基因植株.根据昆虫的总死亡率将转基因植株划分为高抗、中抗、低抗、不抗四个等级,筛选出4个高抗无性系(D-84、D-87、D-94、D-95)、3个中抗无性系(D-74、D-85、D-88).对测试昆虫的生长、发育进行测定,结果表明:各转基因无性系对测试昆虫的生长发育有明显抑制作用,转基因无性系中昆虫各发育龄期比对照明显延长,昆虫体重增长速率比对照明显减慢.说明Bt基因和API基因在植物细胞内能够有效地表达,其表达产物具有较强的毒性.从而提高了该转基因毛白杨雄株的抗虫性.

目录

文摘

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缩略词表

1引言

1.1毛白杨花粉败育和雄性不育研究现状

1.2杨树抗虫基因工程育种研究进展

1.2.1抗虫基因类型及其转化机理

1.2.2杨树抗虫基因转化的研究

1.2.3杨树抗虫基因工程育种中存在的问题

1.2.4展望

2研究目的及意义

3败育毛白杨雄株-D花粉发育的细胞组织学研究

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2研究方法

3.2结果与分析

3.2.1花药发育形态学观察

3.2.2花药壁和花粉的形成和发育

3.3小结

4毛白杨雄株-D双抗虫基因转化的研究

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2研究方法

4.2结果与分析

4.2.1毛白杨雄株-D再生体系的建立

4.2.2选择压及抗生素浓度的确定

4.2.3转化芽的获得与筛选

4.2.4影响转化效果的因素

4.2.5转基因毛白杨雄株的移栽

4.2.6转基因毛白杨雄株的分子生物学检测

4.2.7转基因毛白杨雄株的抗虫性

4.3小结

5讨论与结论

5.1讨论

5.2主要结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢