牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA、PCR诊断方法的建立及E2基因变异分析

摘要

本文对牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA、PCR诊断方法的建立及E2基因变异分析进行了研究。文章建立了检测牛病毒性腹泻病毒的反转录-聚合酶链式反应技术。根据已发表的BVDV标准毒株NADL、Osloss等毒株的全序列，选择BVDV保守性比较强的5’非编码区域，利用计算机辅助软件DNAstar设计合成了一对特异性引物，分别对BVDVNADL株、OrengonC24V和猪瘟兔化弱毒疫苗株等不同毒株进行了PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，BVDVNADL株、OrengonC24V都扩增出了长度约为325bp的片段，而对其他毒株进行扩增，结果均为阴性。扩增产物经BspTI酶切鉴定，证明了该诊断方法具有较强的特异性；敏感性试验证明，该方法可以检测到病毒最低浓度达10-1TCID50。该诊断技术对BVDV检测不仅具有特异、敏感和快速诊断的优点，而且还可以与猪瘟病毒加以区分。

目录

文摘

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1引言

2材料与方法

2.1材料及溶液配制

2.1.1标准毒及标准阳性血清

2.1.2 MDBK细胞

2.1.3实验动物

2.1.4病料来源

2.1.5细胞培养所需主要试剂

2.1.6抗体制备和免疫球蛋白IgG提取所需主要试剂

2.1.7酶标抗体的制备及双抗体夹心ELISA所需的主要试剂

2.1.8 RT-PCR所需的主要化学试剂

2.1.9 RT-PCR所需的主要生物学试剂

2.1.10所需主要仪器

2.1.11分析软件

2.1.12主要溶液的配制

2.2双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

2.2.1细胞培养及病毒的增殖

2.2.2 BVDV的浓缩和纯化

2.2.3兔抗BVDV高免血清的制备

2.2.4高免血清效价的测定

2.2.5免疫球蛋白IgG的提取及纯度鉴定

2.2.6酶标抗体的制备

2.2.7双抗体夹心ELISA试验条件的选择

2.2.8双抗体夹心ELISA试验的操作程序

2.2.9双抗体夹心ELISA的特异性试验

2.3双抗体夹心ELISA对河北省不同地区奶牛感染BVDV的流行病学调查

2.4 RT-PCR检测BVDV抗原方法的建立

2.4.1 BVDV病毒的增殖

2.4.2 BVDV Oregon C24V病毒液TCID50的测定

2.4.3引物的设计与合成

2.4.4病毒RNA的提取

2.4.5反转录合成cDNA

2.4.6 PCR扩增反应

2.4.7扩增产物的检测及酶切鉴定

2.4.8 PCR特异性试验

2.4.9 PCR灵敏性试验

2.4.10 PCR重复性试验

2.5 BVDV不同毒株E2基因的变异分析

2.5.1 BVDV不同毒株E2基因核苷酸序列同源性分析

2.5.2 BVDV不同毒株E2基因氨基酸序列分析

2.5.3 BVDV不同毒株系统发育树的构建

3结果

3.1双抗体夹心ELISA检测方法的建立

3.1.1细胞培养及病毒的增殖结果

3.1.2高免血清效价的测定结果

3.1.3免疫球蛋白IgG的提取及纯度鉴定结果

3.1.4酶标抗体的制备结果

3.1.5双抗体夹心ELISA试验条件的选择结果

3.2双抗体夹心ELISA的初步应用结果

3.3 RT-PCR检测BVDV抗原方法的建立

3.3.1 BVDV Oregon C24V病毒液TCID50的测定结果

3.3.2 RT-PCR扩增结果

3.3.3 RT-PCR特异性试验结果

3.3.4 RT-PCR的酶切鉴定结果

3.3.5 RT-PCR敏感性试验结果

3.3.6 RT-PCR重复性试验结果

3.4 BVDV不同毒株E2基因的序列差异分析

3.4.1核苷酸序列同源性分析结果

3.4.2 BVDV不同毒株氨基酸序列分析结果

3.4.3 BVDV不同毒株系统发育树的构建结果

4 讨论

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢