HT-毒素特异性组分的分离及其在Ht1基因玉米质膜存在结合蛋白的证据

摘要

本研究对玉米大斑病菌1号小种毒素的特异性组分进行分离，建立了高效的特异性毒素分离纯化方法，并对其进行了紫外波谱分析；用荧光素双醋酸酯(FDA)染色法，测定了毒素特异性组分对原生质体死亡率的影响；进而用1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)荧光探针标记法和SDS-PAGE电泳法对特异性毒素组分与Htl基因玉米细胞互作过程中的质膜蛋白进行了研究，旨在证明Htl基因玉米细胞质膜上存在特异性毒素组分结合蛋白(TBP)，为从细胞和分子生物学角度阐明毒素的致病机理提供证据。主要结果如下： 1.对玉米大斑病菌的1号小种菌株(99-2)的粗毒素进行硅胶薄层层析(TLC)，分离到Ⅰ(Rf0.06)、Ⅱ(Rf0.21)、Ⅲ(Rf0.45)、Ⅳ(Rf0.60)、V(Rf0.75)5个条带，分别对此5个条带进行生物测定，发现条带Ⅱ对带Htl基因的玉米具有较强的特异性。 2.在检测波长220nm、流速1.0mL/min的HPLC分析条件下，对条带Ⅱ的洗脱剂中甲醇与水的比例进行摸索，最后确定60﹪甲醇为最佳洗脱条件。经对条带Ⅱ进行高效液相色谱(HPLC)的进一步纯化，得到3种组分Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3，其中只有Ⅱ-3具有特异致病活性。对Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3进行紫外-可见光谱扫描，发现只有Ⅱ-3在300nm处有吸收峰，Ⅱ-1和Ⅱ-2的峰形相似，可能为类似物。 3.从HT-毒素Ⅱ-3组分处理玉米幼苗的叶片中提取原生质体，在0-1.5h内其死亡率与对照(蒸馏水处理幼苗)无明显差别，但1.5h后Ⅱ-3处理一直明显高于对照，说明Ⅱ-3加速了叶片细胞的死亡；在6h左右处理有显著上升，而对照变化不大。说明Ⅱ-3与叶片细胞作用后并不直接伤害细胞，而需经过一定时间，这一过程很可能是Ⅱ-3与受体结合后信号不断放大，最终使原生质体失去活力的过程。 4.以玉米叶片原生质体为研究对象，以ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)作荧光探针，用荧光法研究了Ⅱ-3与质膜蛋白的互作。在被ANS标记后的原生质体悬浮液中加入不同浓度HT-毒素Ⅱ-3组分后，ANS荧光强度明显增加，呈现出了剂量一效应关系，表明Ⅱ-3与质膜上ANS某些受体发生了互作。本试验采用两种试剂，从两个角度表明了ANS受体和质膜上存在的Ⅱ-3受体具有蛋白特性。推测HT-毒素特异性组分的原始作用位点在质膜外侧，且特异性毒素组分与其受体互作具明显的饱和性。 5.利用SDS-PAGE电泳技术分析了HT-毒素Ⅱ-3组分对玉米叶片中可溶性蛋白和质膜蛋白的影响。结果表明，Ⅱ-3对叶片中可溶性蛋白没有影响，但在叶片质膜蛋白中找到了3个与Ⅱ-3致病相关的蛋白，经分析其分子量分别为31.622KD、63.125KD和93.536KD，其中分子量为31.622KD和63.125KD的蛋白为叶片本身所特有。

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1引言

2材料和方法

3结果与分析

4讨论

5结论

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