鸡堆型艾美耳球虫裂殖子单链抗体可变区基因文库的构建

摘要

鸡球虫病对养鸡业的危害程度十分严重，全世界每年因鸡球虫病造成的损失超过20亿美元。最近的研究证明主要由堆型艾美耳球虫感染引起的亚临床型球虫病对养鸡业造成的损失有时要比临床型球虫病大的多，因此对堆型艾美耳球虫进行专门详尽的深入研究是非常必要的。本文建立了针对鸡堆型艾美耳球虫裂殖子抗原的鼠源抗体基因文库，并对其进行了初步鉴定。 本试验利用单卵囊分离技术从鸡场分离了四株纯种艾美耳球虫卵囊，经增殖纯化后，提取卵囊基因组DNA，用特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示其中两株为纯种鸡堆型艾美耳球虫。将增殖的卵囊接种无球虫感染的健康雏鸡，确定提取裂殖子的最佳时间为接种后56小时；并进行第二代裂殖子的提取纯化试验。纯化的裂殖子经超声裂解，高速离心，取上清，得到裂殖子可溶性抗原。将提取的堆型艾美耳球虫裂殖子可溶性抗原与等量佐剂乳化，免疫BALB/C小鼠。采取免疫小鼠的血液，制各阳性血清，应用本实验室建立的间接ELISA方法检测抗体效价，取抗体效价高的小鼠作为脾脏供体。提取脾脏的总RNA，琼脂糖凝胶电泳证明小鼠脾细胞总RNA提取成功。以提取的RNA为模板，利用引物Oligo(dT)<,15>合成cDNA。根据小鼠抗体可变区的恒定区的氨基酸序列设计合成扩增鼠抗体轻链和重链可变区的兼并引物，并以cDNA为模板，扩增出轻链可变区和重链可变区基因。经琼脂糖凝胶电泳检测，发现轻链可变区基因的大小约390bp，重链可变区基因在420bp左右。从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，用回收试剂盒回收轻链、重链可变区，经琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，将回收的轻链基因等量混合即制成轻链可变区基因文库，将回收的重链基因等量混合，即制成重链可变区基因文库。轻链、重链分别与克隆载体PGM-T连接，转化于感受态细胞TOP10，蓝白斑法筛选出阳性重组子。提取阳性质粒DNA并测序。测序结果显示轻链可变区和重链可变区基因符合鼠抗体轻链可变区和重链可变区基因特征，与预期结果一致，证明鼠抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子抗体的轻链可变区基因文库和重链可变区基因文库构建成功。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1鸡球虫病的研究现状

1.1.1鸡球虫的现代研究

1.1.2球虫的体外培养的研究现状

1.1.3球虫的抗原分析和免疫原性的研究现状

1.1.4球虫疫苗的研究现状

1.2基因工程抗体的研究现状

1.2.1抗体的分子结构

1.2.2抗体分子的基本结构

1.2.3抗体分子的功能区结构

1.2.4基因工程抗体的研究进展

2材料与仪器

2.1单卵囊分离及PCR鉴定试验所用主要试剂

2.2提取裂殖子试验所需主要化学试剂

2.3抗原制备及ELISA试验所需主要化学试剂

2.4总RNA提取及反转录所需主要试剂

2.5全套VH和VL基因的扩增与鉴定所需试剂

2.6引物设计与合成

2.6.1球虫虫种PCR鉴定所用引物

2.6.2扩增轻链重链可变区抗体库所需引物

2.7主要仪器设备

3方法与程序

3.1堆型艾美耳球虫单卵囊分离及鉴定

3.1.1实验动物

3.1.2试验虫株及卵囊的培养

3.1.3单卵囊的分离

3.1.4继代增殖

3.1.5虫种的常规鉴定

3.1.6球虫虫种的PCR鉴定

3.2裂殖子抗原提取方法的比较试验及可溶性抗原的制备

3.2.1试验动物

3.2.2提取裂殖子最佳时间的确定

3.2.3四种分离裂殖子方法的比较试验

3.2.4可溶性抗原的制备

3.2.5抗原成分的分析：将抗原进行SDS-PAGE

3.3动物免疫及抗体效价的测定

3.3.1动物免疫

3.3.2阳性血清效价的测定

3.4免疫小鼠脾脏总RNA的提取和cDNA的合成

3.4.1小鼠脾脏总RNA的提取

3.4.2 cDNA第1链的合成

3.5全套VH和VL基因的扩增

3.5.1以逆转录合成的cDNA第1链为模板，分别进行全套VH和VL基因的扩增

3.5.2 VH的PCR扩增

3.5.3 VL的PCR扩增

3.5.4从琼脂糖胶中回收DNA片段：硅胶树脂柱层析法（按试剂盒说明进行）

3.6目的基因的克隆与鉴定

3.6.1 PCR产物与PGM-T载体的连接

3.6.2用氯化钙法制备感受态细胞

3.6.3 转化

3.6.4重组质粒的提取与鉴定

3.6.5重组质粒的鉴定

4结果与分析

4.1单卵囊分离结果

4.2虫种常规鉴定结果

4.3 PCR鉴定结果

4.3.1艾美耳球虫卵囊基因组DNA的提取

4.3.2 PCR反应体系的结果

4.4提取裂殖子的最佳时间

4.5最优化提取裂殖子方案

4.6抗原浓度测定结果

4.7抗原分析（SDS-PAGE电泳结果）

4.8免疫鼠血清效价测定

4.9测定总RNA样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量

4.10轻链、重链可变区PCR结果检测

4.11轻链可变区基因的重组质粒酶切鉴定

4.12重链可变区基因的重组质粒酶切鉴定

4.13轻链、重链可变区基因测序结果及序列分析

5讨论

6结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢