根癌农杆菌介导的富有柿遗传转化体系的研究

摘要

本项研究在已经建立的富有柿叶片的高频再生体系的基础上，对影响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导富有柿叶片遗传转化的条件进行了探索。通过优化转化条件，建立了富有柿叶片遗传转化体系；PCR检测结果初步表明，已获得了ACC合成酶的RNAi的转基因植株。主要研究结果如下： 1.研究了选择抗生素壮观霉素和抑菌剂头孢霉素对叶片直接分化不定芽的影响。结果表明，叶片外植体对壮观霉素非常敏感，在分化培养基中附加30 mg/L的壮观霉素即可完全抑制不定芽的分化：在生根试验中，确定Sp生根压力为20 mg/L。头孢霉素叶片外植体的分化没有严重影响，300 mg/L的头孢霉素就能较好的抑制农杆菌的生长，且不定芽诱导率可达到46.3％. 2.建立了以富有柿叶片为转化受体的根癌农杆菌遗传转化体系，详细探讨了预培养时间、共培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间、AS浓度等因素对于T-DNA转化的影响，并优化了转化条件。结果表明，选择预培养3 d的叶片，用OD<,600>为0.4的菌液侵染7 min后，转到1/2MS+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+AS 150 umol/L的培养基上共培养4 d，再通过延迟筛选4 d，可获得较好的转化效果，抗性芽率最高的可达13.64.％。 3.通过建立的遗传转化体系，获得246株抗性苗，其中4株经PCR检测呈阳性。 4.研究了暗培养时间、蔗糖浓度、光照强度、闭瓶锻炼时间对培育富有柿健壮生根苗的效果。结果表明，在蔗糖浓度为20 g/L的培养基中生长的试管苗，暗培养8 d，在30 000 1x的光照下，闭瓶锻炼21 d，对富有柿培育健壮生根苗有很大的促进作用。此条件下，培育的生根苗较好：生根率高，根系发达，试管苗生长健壮，芽点饱满。 5.初步探讨了温度、湿度和移栽基质对移栽成活率的影响，生根试管苗移栽到以蛭石：珍珠岩=1:1的基质中，进行过渡移栽。保持小拱棚温度在25～30℃。移栽前10 d，保持棚内湿度在90％～100％，能获得较好的移栽成活率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1引言

1.1木本果树基因工程研究概述

1.1.1木本果树遗传转化方法

1.1.2影响木本果树遗传转化的因素

1.2乙烯调控果实成熟研究进展

1.2.1 ACC合成酶(ACS)

1.2.2 ACC氧化酶(ACO)

1.3培育健壮生根组培苗的研究

1.4试管苗移栽环境的研究

1.5研究的目的、意义

2材料与方法

2.1植物材料及培养方法

2.1.1植物材料

2.1.2培养基

2.2转化载体材料及培养方法

2.2.1根癌农杆菌菌株及质粒

2.2.2根癌农杆菌的培养

2.3试剂及配方

2.3.1组织培养试剂(母液)

2.3.2生化试剂

2.3.3质粒提取试剂

2.3.4植物DNA提取试剂

2.4主要试验药品及仪器

2.5富有柿对抗生素敏感性的试验

2.5.1富有柿对壮观霉素的敏感性

2.5.2头孢霉素对农杆菌的抑制效果及对叶片再生的影响

2.6农杆菌介导的遗传转化方法

2.6.1转化程序

2.6.2农杆菌菌株EHA101生长曲线的测定

2.6.3不同预培养时间对富有柿遗传转化的影响

2.6.4不同农杆菌菌液浓度对富有柿遗传转化的影响

2.6.5不同侵染时间对富有柿遗传转化的影响

2.6.6不同共培养时间对富有柿遗传转化的影响

2.6.7 AS浓度及添加方式对富有柿遗传转化的影响

2.6.8共培养培养基类型对富有柿遗传转化的影响

2.6.9不同筛选方法对富有柿遗传转化的影响

2.6.10转基因植株的PCR检测

2.6.11培育健壮生根试管苗的研究

2.6.12富有柿试管苗的移栽

2.7评价指标和计算公式

2.8培养条件

2.9数据分析

3结果与分析

3.1富有柿对壮观霉素的敏感性

3.1.1富有柿叶片对壮观霉素的敏感性

3.1.2富有柿生根苗对壮观霉素的敏感性

3.2头孢霉素对农杆菌的抑制效果及对叶盘再生的影响

3.3遗传转化体系的建立

3.3.1农杆菌EHA101生长曲线的测定

3.3.2预培养时间对富有柿遗传转化的影响

3.3.3菌液浓度对富有柿遗传转化的影响

3.3.4侵染时间对富有柿遗传转化的影响

3.3.5共培养时间对富有柿遗传转化的影响

3.3.6乙酰丁香酮(AS)的添加方式及浓度对富有柿遗传转化的影响

3.3.7共培养培养基类型对富有柿遗传转化的影响

3.3.8筛选方法对富有柿遗传转化的影响

3.4转化植株的PCR检测结果

3.5培育健壮生根试管苗的技术研究

3.5.1暗培养天数对培育健壮生根苗的影响

3.5.2蔗糖浓度对培育健壮生根苗的影响

3.5.3“闭瓶锻炼”时间对培育健壮生根苗的影响

3.5.4光照强度对培育健壮生根苗的影响

3.6富有柿试管苗移栽环境的探讨

3.6.1温度对植株和根系生长的影响

3.6.2湿度对试管苗移栽存活率的影响

3.6.3移栽基质对试管苗移栽存活率的影响

3.6.4移栽后的管理

4讨论

4.1富有柿转基因工艺的探讨

4.2关于低转化率的问题

4.3关于假阳性植株的问题

4.4培育健壮生根苗的研究

4.5富有柿试管苗移栽存活率低的问题

4.6本研究的下一步工作

5结论

5.1壮观霉素和头孢霉素浓度的确定

5.2富有柿转基因工艺的确定

5.3富有柿抗性苗的PCR检测

5.4培育富有柿健壮生根苗的技术研究

5.5富有柿试管苗移栽条件的探讨

参考文献

在读期间发表的学术论文

附图

作者简历

致谢