瓜蒌（Trichosanthes kirilowii）等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆

摘要

活血化瘀中草药具有“通利血脉，促进血行，消散瘀血”等主要作用，现代药理学研究也证明了活血化瘀中草药可以改善血液的血流动力学、血液流变学和微循环。目前已经从多种生物体内分离出来了能有效治疗血栓性疾病的纤溶酶，多属于丝氨酸蛋白酶类。本文的研究目的是筛选出具有纤溶酶活性的中草药品种，并对其进行分离和性质鉴定。 首先选取瓜萎等42种在临床上具有活血化瘀作用的中草药，水浸提物经硫酸铵沉淀得到蛋白质提取物，利用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性，筛选具有纤溶酶活性的中草药品种。结果表明，瓜萎、稀莶草、望江南、延胡索、益母草、竹节三七、牛膝、泽泻的蛋白质提取物具有明显的体外纤溶酶活性。 将其中的牛膝、稀莶草水浸提物通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Scpharose离子交换层析分离，得到的牛膝40％-4、稀莶草60％-1、稀莶草60％-2、稀莶草60％-3和稀莶草80％-2组分具有较高的纤溶酶比活力。 利用蛋白酶抑制剂对益母草纤溶酶提取物进行处理，结果表明，苯甲基磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、苯甲脒能完全抑制益母草纤溶酶活性，EDTA、胃抑肽素、亮抑肽素、抑肽酶有部分抑制作用。认为益母草纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。 利用苯甲脒为配基、环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体，制备亲和层析分离介质。对益母草纤溶酶提取物进行亲和层析分离，得到具有纤溶酶活性、表观分子量分别为60 kD和33 kD的蛋白质组分。 纤维蛋白平板、Fibrin-PAGE检测，新鲜瓜萎蛋白提取物及瓜蒌蛋白提取物均具有纤溶酶活性。蛋白酶抑制剂实验表明，PMSF、大豆胰蛋白酶抑制剂可以完全抑制瓜萎纤溶酶的活性，苯甲脒、鸡卵类粘蛋白有一定的抑制作用，说明瓜蒌纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。用不同的蛋白质作为作用底物，发现瓜萎纤溶酶提取物能够有效降解纤维蛋白原和纤维蛋白，而对牛血清白蛋白、牛血红蛋白、人免疫球蛋白基本无降解作用，表明该纤溶酶提取物毒副作用小。激活活性实验表明，瓜萎纤溶酶的纤溶酶原激活活性明显高于其直接溶纤的活性，属于纤溶酶原激活剂。利用人工合成底物BAEE测定瓜蒌纤溶酶提取物，表明该物质具有胰蛋白酶活性，分析认为瓜萎纤溶酶是将纤溶酶原中Arg<,557>-Ile<,558>键断裂，产生了纤溶酶。 由于大豆胰蛋白酶抑制剂对瓜萎纤溶酶的活性完全抑制，因此选用大豆胰蛋白酶抑制剂为配基，以环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体制备亲和层析介质，利用亲和层析对新鲜瓜蒌蛋白提取物进行了分离。得到了两个具有活性的、表观分子量分别为67 kD和55 kD的蛋白酶组分。 瓜蒌纤溶酶提取物经DEAE-Sepharoso和CM-Sepharose离子交换，分离出了表观分子量为62.5 kD的蛋白质组分(TkP-Ⅰ)，其比活力为109.81 U/mg，样品纯化了3.58倍。 利用植物丝氨酸蛋白酶N-末端序列，以及通过对植物丝氨酸蛋白酶的同源蛋白多重序列的比对，利用保守序列的氨基酸设计兼并引物，采用RT-PCR方法，扩增得到瓜萎部分基因序列。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

引言

第1章文献综述

1.1溶栓药物的研究进展

1.1.1血栓性疾病

1.1.2 临床应用的主要溶栓药物

1.1.3溶栓药物的研究进展

1.1.4植物源溶栓药物的研究进展

1.2纤溶酶的性质及作用机制

1.2.1氨酸蛋白酶的分类及其作用机制

1.2.2植物丝氨酸蛋白酶的研究进展

1.3溶栓活性体外检测方法

1.3.1纤维蛋白平板法

1.3.2发色底物法

1.3.3酶联纤维蛋白溶解法

1.3.4凝块溶解时间法

1.3.5n-苯甲酰-l-精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE）底物法

1.3.6纤维蛋白自显影法和纤维蛋白-聚丙烯酰胺电泳法(Fibrin-PAGE)

第2章活血化淤中草药纤溶酶的筛选与鉴定

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2试剂

2.1.3仪器

2.1.4方法

2.2结果与分析

2.2.1活血化淤中草药纤溶酶的筛选

2.2.2具有纤溶酶活性的中草药蛋白质含量

2.2.3蛋白质提取物比活力的计算

2.3讨论

第3章牛膝、稀莶草纤溶酶的离子交换分离

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2溶液

3.1.3仪器

3.1.4方法

3.2结果与分析

3.2.1中草药样品的脱色素处理

3.2.2离子交换缓冲液pH的确定

3.2.3 DEAE-Sepharose离子交换分离纯化蛋白

3.3讨论

第4章益母草纤溶酶的亲和层析分离

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2试剂

4.1.3溶液

4.1.4仪器

4.1.5方法

4.2结果与分析

4.2.1蛋白酶抑制剂对益母草纤溶酶提取物的影响

4.2.2苯甲脒偶联树脂最佳浓度的确定

4.2.3益母草纤溶酶纯化分析

4.3讨论

第5章瓜蒌纤溶酶的部分酶学性质

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2试剂

5.1.3方法

5.2结果与分析

5.2.1蛋白酶抑制剂对瓜蒌纤溶酶提取物活性的抑制作用

5.2.2瓜蒌纤溶酶提取物胰蛋白酶的活性测定

5.2.3瓜蒌纤溶酶提取物对牛血红蛋白的水解

5.2.4瓜蒌纤溶酶提取物对牛血清白蛋白的水解作用

5.2.5瓜蒌纤溶酶提取物对人免疫球蛋白G的水解作用

5.2.6瓜蒌纤溶酶提取物对纤维蛋白原的水解作用

5.2.7瓜蒌纤溶酶提取物对纤维蛋白的水解作用

5.2.8温度对瓜蒌纤溶酶提取物稳定性的影响

5.2.9 pH对瓜蒌纤溶酶提取物稳定性的影响

5.2.10瓜蒌纤溶酶提取物激酶活性的检测

5.3讨论

第6章瓜蒌纤溶酶的分离纯化

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2试剂

6.1.3大豆胰蛋白酶抑制剂的活性测定

6.1.4瓜蒌粗提物的制备

6.1.5鲜瓜蒌粗提物的制备

6.1.6亲和层析分离瓜蒌纤溶酶的粗提物

6.1.7反相层析分离瓜蒌纤溶蛋白

6.1.8瓜蒌纤溶酶的离子交换分离

6.1.9 Sephacryl S-100分离瓜蒌酶

6.1.10制备电泳分离瓜蒌纤溶酶

6.1.11酸性电泳检测瓜蒌纤溶酶

6.1.12纯化蛋白质的分析

6.1.13等电聚焦电泳测定纯化的瓜蒌纤溶酶

6.2结果与分析

6.2.1纤溶酶活性测定

6.2.2瓜蒌纤溶酶的亲和层析

6.2.3反相层析分离瓜蒌纤溶酶

6.2.4 DEAE-Sepharose离子交换平衡缓冲液pH的确定

6.2.5等电点的测定

6.3讨论

第7章瓜蒌纤溶酶的基因克隆及序列分析

7.1材料与方法

7.1.1材料

7.1.2试剂

7.1.3仪器

7.1.4方法

7.2结果与分析

7.2.1瓜蒌纤溶酶兼并引物的设计

7.2.2瓜蒌果实总RNA的提取及检测

7.2.3瓜蒌蛋白酶cDNA的克隆和测序

7.3讨论

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

发表论文一

发表论文二

个人简历

致谢