瓜蒌(Trichosanthes kirilowii)纤溶酶的分离纯化与性质分析

摘要

血栓性疾病严重危害人类的健康和生命，研制开发特异、高效、安全的溶血栓药物，成为近年来生命科学的热门课题之一。研究证明，活血化瘀中草药可以改善血流动力、血流变和微循环，对于血栓性疾病有良好的治疗效果。本实验室前期工作表明，中草药瓜蒌（Trichosanthes kirilowii）具有显著的体外溶解纤维蛋白的活性，因此，本研究在此基础上从瓜蒌中分离纯化体外具有高纤溶活性的蛋白酶，并对其性质进行研究。
　　 利用硫酸铵沉淀法和等电点沉降法得到瓜蒌蛋白提取物。通过亲和层析（环氧氯丙烷活化法制备以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的Sepharose4B亲和层析载体）、离子交换层析等方法从瓜蒌蛋白提取物中分离得到了两个具有纤溶活性、表观分子量分别为66.0kD和55.6 kD的蛋白酶组分；经SDS-PAGE后转PVDF膜，对55.6 kD的蛋白酶N端氨基酸进行测序，得到N端10个氨基酸序列为N-DVRSPRDTDE，经NCBI比对结果表明，与其他生物来源的纤溶酶序列相似性均低30％，是一种新型纤溶酶，命名为TkFE。
　　 蛋白酶抑制剂结果表明该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类；它的pI为9.5；相当于胰蛋白酶活性为2.47U·mg-1； pH稳定性良好，最适pH为9.0；4-40℃保持最高活力，活性稳定；Ag+完全抑制TkFE的活性，Cu2+部分抑制TkFE活性，剩余活性为72.25％，Mg2+、Mn2+、Na+、K+对TkFE的活性均有一定的激活作用；在以酪蛋白为底物的水解反应中，温度、酶底物比、pH、反应时间4种因素对水解反应的影响力大小为：温度>酶底物比>反应时间>pH； Km值为1.89 mg·mL-1；分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆盐体外处理TkFE，结果表明，胰蛋白酶和胆盐对TkFE活性无影响，在pH3.0环境下TkFE被胃蛋白酶水解后纤溶活性升高。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第1章 绪论

1.1血栓概况

1.1.1血栓

1.1.2血栓的形成和溶解机制

1.1.3血栓性疾病与恶性肿瘤

1.1.4血栓性疾病的治疗

1.2血栓性疾病治疗药物的研究进展及应用

1.2.1抗凝血药物

1.2.2抗血小板药物

1.2.3溶栓药物

1.3植物溶栓药物的研究状况

1.3.1中草药对血栓性疾病的治疗

1.3.2中草药溶栓药物的研究进展

第2章 瓜蒌纤溶酶的分离纯化

2.1材料与试剂

2.1.1材料

2.1.2试剂和缓冲液

2.1.3主要仪器设备

2.2方法

2.2.1瓜蒌蛋白提取物的制备

2.2.2纤溶活性测定方法

2.2.3蛋白质含量的测定

2.2.4等电聚焦电泳

2.2.5 DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析

2.2.6 CM-Sepharose fast flow阳离子交换层析

2.2.7亲和载体的制备与亲和层析

2.2.8大豆胰蛋白酶抑制剂的活性测定

2.2.9 SDS-PAGE

2.2.10转膜与测序

2.3结果与分析

2.3.1亲和层析载体制备

2.3.2亲和层析分离瓜蒌蛋白

2.3.3等点聚焦电泳

2.3.4等电点沉降法提取瓜蒌蛋白

2.3.5 DEAE阴离子交换层析

2.3.6 CM阳离子交换层析

2.3.7 TkFE N-端序列测定

2.3.8蛋白纯化方案评价

2.4讨论

第3章 瓜蒌纤溶酶的性质分析

3.1材料与试剂

3.1.1实验材料

3.1.2试剂

3.2实验方法

3.2.1 TkFE激酶活性检测

3.2.2 TkFE胰蛋白酶活性检测

3.2.3最适温度及温度稳定性

3.2.4最适pH及pH稳定性

3.2.5蛋白酶抑制剂对TkFE活性的影响

3.2.6金属离子对TkFE活性的影响

3.2.7 TkFE的Km值测定

3.2.8 TkFE的酶学正交试验

3.2.9胃蛋白酶、胰蛋白酶和胆盐对TkFE活性的影响

3.3结果与分析

3.3.1 TkFE激酶活性检测

3.3.2最适温度及温度稳定性

3.3.3最适pH及pH稳定性

3.3.4蛋白酶抑制剂对TkFE活性的影响

3.3.5 TkFE的胰蛋白酶活性

3.3.6金属离子对TkFE活性的影响

3.3.7 TkFE的Km值

3.3.8 TkFE的酶学正交实验

3.3.9胃蛋白酶、胰蛋白酶和胆盐对TkFE活性的影响

3.4讨论

结论

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文

致 谢