苏云金芽孢杆菌菌株的分离和cry基因的鉴定

摘要

本研究从河北各地区，东北地区，四川九寨沟，云南的昆明和丽江的林地和农田采集土壤187份，分离出Bt野生菌株76株，伴孢晶体类型有菱形、方形、球型，充分体现了我国菌株资源的多样性。筛出Bt菌株的土样共有14份，筛出率为7．5％。 利用18对鉴定cry基因型的通用引物对以上76株菌和本室保存的57株菌进行了PCR和PCR-RFLP鉴定：含有cry1型基因的菌株有76株，含有cry2基因型的菌株有13株，含有cry7基因型的菌株有2株，含有cry8基因型的菌株有30株，含有cry9基因型的菌株有6株，含有cry11基因型的菌株有20株，含有cry30基因型的菌株有1株，含有cry32基因型的菌株有1株，含有cry40基因型的菌株有1株。有21株未鉴定出基因型。133株野生菌株的伴孢晶体SDS-PAGE分析结果表明：13株同时含有cry1型基因和cry2型基因的菌株表达130kDa和60kDa的蛋白，其伴孢晶体为菱形和方形；38株只含有cry1Ac基因型的菌株，都表达了130kDa的蛋白，其伴孢晶体为菱形，细小菱形，方菱形，菱形和方形。30株含有cry8基因型的菌株，表达了130kDa 的蛋白，伴孢晶体为球型。 菌株PCR产物测序结果的同源分析表明：新菌株CY1的基因与模式基因(GenBank：U04367)的同源性为99．09％，可以推测出菌株CY1可能是一株含有cry7Ab基因的新菌株，对鞘翅目害虫有杀虫活性。根据模式菌株BTS137J的基因序列(GenBank：M64478)使用Premier Primier5软件设计了Cry7-2F/Cry7-2S，Cry7-12F/Cry7-13S，Cry7-3F/Cry7-3S三对引物用于扩增菌株CY1的全长序列。得到了1569bp，2132bp，1306bp的产物。 含有cry8基因的30株菌株经过酶切分析基因型都为cry8Ea。可以预测这些菌株可能对鞘翅目害虫有活性。 WFS-97和WFS-12分别含有cry30和cry40的基因，两菌株应该对双翅目害虫具有杀虫活性。这些基因与已知基因的同源性均低于95％，所以根据新的命名法，这几个基因可能为在第二分类等级上有差异的新基因。 部分菌株对棉铃虫和小菜蛾做了生物活性测定，对于已得到鉴定结果的菌株，其杀虫活性与预测的杀虫活性相一致。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1苏云金芽孢杆菌的生物学特性及其分布

1.2苏云金芽孢杆菌的分离

1.3苏云金芽孢杆菌的血清型及其亚种

1.4苏云金芽孢杆菌的毒素

1.5苏云金芽孢杆菌的cry基因分类及其鉴定

1.5.1苏云金芽孢杆菌cry基因分类系统的建立

1.5.2苏云金芽孢杆菌cry基因的鉴定方法

1.6苏云金芽孢杆菌的cry基因与伴孢晶体形态及杀虫活性的关系

1.7本研究的目的及意义

2材料和方法

2.1材料及仪器

2.1.1材料

2.1.2试剂

2.1.3仪器设备

2.2研究方法

2.2.1苏云金芽孢杆菌的分离方法

2.2.2菌种的保存

2.2.3模板的制备

2.2.4 Bt质粒DNA的提取

2.2.5 PCR反应

2.2.6酶切分析

2.2.7琼脂糖凝胶电泳

2.2.8 SDS-PAGE电泳

2.2.9序列测定及分析

2.2.10菌株杀虫活性测定

3结果与分析

3.1菌株分离

3.2菌株的伴孢晶体形态的多样性

3.3苏云金芽孢杆菌cry基因的鉴定

3.4菌株CY1的基因型分析

3.5菌株CY1晶体蛋白的SDS-PAGE

3.6菌株cry8基因的PCR-RFLP鉴定

3.7含有cry8基因的菌株的SDS-PAGE

3.8含有cry30，cry40，cry32基因的菌株的鉴定

3.9对鳞翅目害虫有效的晶体蛋白基因的PCR-RFLP鉴定和SDS-PAGE

3.9.1菌株DP的PCR-RFLP鉴定

3.9.2部分含有cry1型基因菌株的SDS-PAGE

3.10部分菌株生物测定结果

3.11部分菌株晶体蛋白基因序列分析

4讨论

5结论

参考文献

在读硕士期间发表论文

作者简历

致谢