华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定

摘要

华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)为鞘翅目鳃金龟科昆虫,是国内外公认的难防治的土栖性害虫。围食膜(peritrophic membrane,PM)是昆虫体内保护其中肠的第一道天然屏障,在昆虫中肠的消化过程及保护昆虫免受微生物和寄生虫侵害等方面发挥着重要作用。昆虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定能够为深入研究害虫的生防机制,寻找生物防治新靶标,以及进一步明确围食膜与病原微生物之间相互作用的分子机理等提供前提和基础。本研究在构建华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库的基础上,对其进行免疫筛选,并对筛选得到的围食膜靶标蛋白进行了分离与鉴定,所得的主要结果如下:
　　 1.提取华北大黑鳃金龟幼虫中肠总RNA,分离得到mRNA,利用Uni-ZAP XR载体,成功构建高质量的华北大黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库。经鉴定,该cDNA文库滴度为5.18×106pfu／mL,重组率为98.8％,扩增后文库滴度为2.36×109pfu／mL,插入cDNA片段的长度平均为1.85kb。其后,以棉铃虫(Helicoverpa armigera)围食膜蛋白血清为抗体,对该文库进行免疫筛选。经过筛选,共得到阳性克隆254个。其中包括4个全长基因HoCBP2、HoCBP76、HoSCP、HoChi,以及1个基因片段HoIIM。
　　 2.HoCBP2基因及HoCBP76基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫围食膜几丁质结合蛋白。其中HoCBP2基因全长2226bp,GenBank登录号为JF681185,开放阅读框长1947bp,编码649个氨基酸。HoCBP2蛋白N-端具有19个氨基酸的前导信号序列,预期蛋白分子量70.2kDa,等电点3.52。Blast比对结果显示,其序列与鞘翅目昆虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)围食膜蛋白PMP14(GenBank登录号GU128106)相似性最高,为35％。结构域分析表明HoCBP2蛋白包含8个具有peritrophin-A结构特征的几丁质蛋白结合功能域(CBD,chitin binding domain)。HoCBP76基因全长2019bp,GenBank登录号为JF681186,开放阅读框长1725 bp,编码575个氨基酸。HoCBP76蛋白N-端具有19个氨基酸的前导信号序列,预期蛋白分子量62.3kDa。等电点3.51。Blast比对结果表明,其序列与Tribolium castaneum围食膜蛋白PMP14相似性最高,为34％。结构域分析表明HoCBP76蛋白包含7个CBD。成功构建原核表达载体pET21b-HoCBP2和pET21b-HoCBP76,分别表达了约120 kDa及110 kDa的目的蛋白。
　　 利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建了重组表达载体Bac-HoCBP2及Bac-HoCBP76,转染BTI-Tn-5B1-4细胞,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。Westernblot检测表明,重组后的HoCBP2和HoCBP76蛋白表达的蛋白分子量约为120kDa和110kDa。几丁质结合活性试验结果表明,HoCBP2和HoCBP76重组蛋白均具有几丁质结合活性,重组蛋白经PBS及1M NaCl处理后,不能从几丁质／蛋白复合物中解离,而用强变性剂6M尿素及1％Calcoflour处理后,重组蛋白从几丁质／蛋白复合物中大量释放。成功分离得到HoCBP2及HoCBP76的特异抗体,Western blot检测发现HoCBP2和HoCBP76在华北大黑鳃金龟幼虫中肠前、中,后部均匀分布,围食膜、中肠、粪便及卵中均存在CBP蛋白,而在其体壁、消化液、脂肪体、蜕及马氏管中未见阳性信号。
　　 3.HoChi基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫几丁质酶,该基因全长1636bp,GenBank登录号为HM596340,开放阅读框长1458bp,编码486个氨基酸,预期蛋白分子量为51.8kDa,等电点为5.58。其5’端和3’端各有一个长27bp和145bp的非翻译区,在polyA末端上游39bp处有一个多聚腺甘酸终止信号序列AAGAAA。该蛋白具有典型的几丁质酶特性,即一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个C端苏氨酸富集区和一个几丁质结合域,属于几丁质酶18家族。其氨基酸序列与赤拟谷盗几丁质酶蛋白(GenBank登录号NM001044629)具有较高的相似性。将该基因与pET28b载体重组后,经IPTG诱导,Western blot鉴定,该蛋白在大肠杆菌中得到表达。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建重组表达载体pFastBac-HoChi,转染BTI-Tn-5B1-4细胞后,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。
　　 4.HoSCP基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫丝氨酸羧肽酶,GenBank登录号为JF681184。该基因全长1830bp,开放阅读框长1371 bp,编码457个氨基酸。推导的蛋白质分子量为51.2kDa,等电点为6.12。其5’端具有78bp的非翻译区及起始密码子ATG,3’端具有381bp的非翻译区,并且含有终止密码子TAA,在polyA末端上游14bp处有一个多聚腺甘酸终止信号序列AATAAA。N-末端具有15个氨基酸的前导信号序列,表明其是分泌型蛋白。序列分析表明,HoSCP含有一个保守的S10肽酶结构域、一个丝氨酸活性位点序列IAGESYAG、一个组氨酸活性位点序列FAFLkVYGAGHMVPMDQP以及两个N-联糖基化位点,并且含有丝氨酸羧肽酶保守催化三联体位点Ser-185,Asp-361,His-418。将该基因与pET28b载体重组后,经IPTG诱导,Western blot鉴定,该蛋白在大肠杆菌中得到表达。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建重组表达载体pFastBac-HoSCP,转染BTI-Tn-5B1-4细胞后,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。
　　 5.HoIIM基因,编码华北大黑鳃金龟肠幼虫围食膜粘蛋白,长1879bp,最长读码框长1707bp,编码569个氨基酸,GenBank登录号为JF681187。结构域分析表明,HoIIM蛋白5个具有peritrophin-A结构特征的几丁质结合功能域、5个粘蛋白结构域。其粘蛋白结构域富含苏氨酸(Thr,T)、脯氨酸(Pro,P)和丝氨酸(Ser,S),分别占29.3％、15.5％及3.91％,并含有大量重复序列,其中PTTTPTT共重复15次,PTSTTTPTTITT及STTTT分别重复5次,TTPTTP重复4次。对华北大黑鳃金龟幼虫围食膜蛋白组分的银染分析表明,其围食膜蛋白种类较多。其中分子量大小大约为160kDa和80kDa的两条蛋白条带,与经PAS方法检测到的呈明显红色的两种糖蛋白大小相符。从粉纹夜蛾颗粒体病毒中分离得到增效蛋白Enhancin,离体处理华北大黑鳃金龟幼虫围食膜后,Western blot检测发现有一条分子量较大的围食膜蛋白条带明显消失,而相应的一些小分子量的围食膜蛋白条带有所增加。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

1.1 围食膜的分类、形成及组分

1.1.1 围食膜的种类

1.1.2 围食膜的形成机制

1.1.3 围食膜的组分

1.2 围食膜的结构及功能

1.2.1 围食膜的结构模型

1.2.2 围食膜的功能

1.3 围食膜内潜在的害虫防治靶标位点

1.4 昆虫杆状病毒表达系统

1.4.1 昆虫杆状病毒表达系统的特点

1.4.2 昆虫杆状病毒表达系统的应用

1.4.3 影响杆状病毒表达系统表达外源蛋白的因素

1.4.4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

1.5 选题依据及目的意义

第2章 华北大黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库的构建

2.1 材料

2.1.1 供试昆虫

2.1.2 供试菌株及试剂盒

2.1.3 培养基

2.1.4 试剂及溶液

2.1.5 仪器设备

2.2 方法

2.2.1 华北大黑鳃金龟中肠组织的收集

2.2.2 总RNA的提取

2.2.3 mRNA分离纯化

2.2.4 cDNA的合成

2.2.5 cDNA的分级、纯化及定量

2.2.6 cDNA与载体λZAP的连接与包装

2.2.7 cDNA文库重组率、库容量检测

2.2.8 cDNA文库的扩增

2.2.9 cDNA文库质量鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 总RNA的提取

2.3.2 mRNA的分离纯化

2.3.3 cDNA第一链和第二链的合成

2.3.4 cDNA分级分离及定量

2.3.5 cDNA文库的滴度及重组率检测

2.3.6 cDNA文库插入片断大小的PCR鉴定

2.4 讨论

2.4.1 cDNA文库的构建方法

2.4.2 影响cDNA文库构建质量的因素

2.4.3 cDNA文库的应用

2.5 小结

第3章 华北大黑鳃金龟cDNA表达文库的免疫筛选

3.1 材料

3.1.1 文库、抗体及宿主菌

3.1.2 主要工具酶及试剂

3.1.3 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 XL1-Blue大肠杆菌感受态的制备

3.2.2 cDNA文库单克隆的制备

3.2.3 转膜

3.2.4 免疫和显色反应

3.2.5 阳性克隆的第二轮筛选

3.2.6 阳性克隆的鉴定

3.2.7 cDNA的序列分析

3.3 结果与分析

3.3.1 阳性克隆的筛选

3.3.2 阳性克隆的鉴定

3.3.3 阳性克隆基因的序列分析

3.4 讨论

3.4.1 cDNA文库的免疫筛选

3.4.2 影响免疫筛选的因素

3.5 小结

第4章 华北大黑鳃金龟围食膜几丁质结合蛋白HoCBP2及HoCBP76的克隆、表达及功能分析

4.1 材料与方法

4.1.1 菌株、细胞及载体

4.1.2 试剂

4.1.3 CBP基因的克隆与测序分析

4.1.4 CBP基因的原核表达

4.1.5 CBP基因的真核表达

4.1.6 CBP蛋白功能检测

4.1.7 CBP蛋白在H.oblita幼虫组织中的免疫定位

4.2 结果与分析

4.2.1 HoCBP2及HoCBP76的序列分析

4.2.2 HoCBP2及HoCBP76的原核表达

4.2.3 HoCBP2和HoCBP76在Bac-to-Bac系统中的表达

4.2.4 HoCBP2和HoCBP76重组蛋白的几丁质活性检测

4.2.5 CBP蛋白在H.oblita幼虫组织中的免疫定位

4.3 讨论

4.4 小结

第5章 华北大黑鳃金龟几丁质酶HoChi的分离鉴定

5.1 材料与方法

5.1.1 菌株、细胞及载体

5.1.2 主要试剂及工具酶

5.1.2 几丁质酶HoChi基因的鉴定与测序分析

5.1.3 几丁质酶HoChi基因的原核表达

5.1.4 几丁质酶HoChi基因的真核表达

5.1.5 重组杆状病毒DNA的提取及PCR鉴定

5.2 结果与分析

5.2.1 HoChi基因的序列分析

5.2.2 华北大黑鳃金龟HoChi与几种其他昆虫几丁质酶氨基酸序列的比较分析

5.2.3 华北大黑鳃金龟HoChi重组载体的构建和表达

5.2.4 几丁质酶HoChi基因的真核表达

5.3 讨论

5.3.1 HoChi基因属于典型的昆虫18家族Ⅰ亚族几丁质酶

5.3.2 HoChi基因序列保守性分析

5.3.3 华北大黑鳃金龟幼虫中肠HoChi基因的应用前景

5.4 小结

第6章 华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶HoSCP的分离鉴定

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.2 H.oblita中肠cDNA文库的筛选及序列分析

6.1.3 HoSCP基因的原核表达

6.1.4 HoSCP基因的真核表达

6.2 结果与分析

6.2.1 HoSCP基因序列分析

6.2.2 丝氨酸羧肽酶的原核表达

6.2.3 丝氨酸羧肽酶的真核表达

6.3 讨论

6.4 小结

第7章 华北大黑鳃金龟围食膜肠粘蛋白HoIIM的分离鉴定

7.1 材料与方法

7.1.1 供试昆虫及试剂

7.1.2 H.oblita幼虫围食膜的提取

7.1.3 PAS染色所需试剂的配制

7.1.4 H.oblita幼虫围食膜蛋白组分分析

7.1.5 病毒增效蛋白Enhancin对H.oblita幼虫围食膜的影响

7.1.6 H.oblita中肠cDNA表达文库的筛选及HoIIM的测序分析

7.2 结果与分析

7.2.1 H.oblita幼虫围食膜蛋白组分分析

7.2.2 Enhancin对H.oblita幼虫围食膜的影响

7.2.3 HoIIM基因的序列分析

7.3 讨论

7.3.1 颗粒体病毒增效蛋白对昆虫围食膜的影响

7.3.2 IIM的结构特征

7.4 小结

全文结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢

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