苏云金芽孢杆菌菌株的分离及cry8型基因的克隆

摘要

苏云金芽孢杆菌菌株的发掘及新型cry8类基因的分离克隆对鞘翅目害虫的防治具有重要的意义。本研究利用温度筛选法,对采自河北省各市县的254份土壤样品进行分离,共得到42株野生型Bt菌株,伴孢晶体类型有球形、菱形、方形和不规则形,充分体现了河北省Bt菌株资源的多样性。利用通用引物S5un8/S3un8对42株野生型菌株的cry8类基因进行PCR鉴定,其中10株含有cry8型基因,其晶体形态均为球形。利用26对cry基因的通用引物鉴定这10株菌所含的其它cry基因型,结果均为阴性,说明仅含有cry8类基因。10株Bt菌株主要表达130kDa左右的蛋白,但大小有差异,推测10株菌中所含的cry8基因类型有所不同,体现了河北省内cry8型基因资源的丰富性。10株含有cry8型基因的Bt菌株来自于河北省的不同地区,说明了此类Bt菌株在河北省内分布的广泛性。
　　 菌株173A中同时含有一个新型的cry8类基因和一个cry8Fa类基因,两个基因的全长序列分别被克隆、测序。其中,新型cry8基因的开放阅读框为3702bp,编码由1233个氨基酸残基组成的蛋白质,预测相对分子量为139.78kDa,等电点为pI4.43,为弱酸性蛋白,该基因与模式基因cry8Ab(EU044830)的序列同源性最高,为85.0％,属第三等级的新基因;cry8Fa基因的开放阅读框为3525bp,编码由1174个氨基酸残基组成的蛋白质,预测相对分子量为133.07kDa,等电点为pI4.50,为弱酸性蛋白,该基因与模式基因cry8Fa1(AY551093)的序列同源性高达99.7%,属于第四等级的新基因。将两个基因与表达载体pET-21b连接,转化E.coliBL21得到高效表达。两个基因的全长序列已在GenBank中登记注册,Accessionnumber分别为JN709441,JN709442。
　　 菌株160C中同时含有一个cry8Ea基因和一个cry8Fa基因,克隆得到其中的cry8Ea基因并完成全序列的测定。cry8Ea基因的开放阅读框为3495bp,编码由1164个氨基酸残基组成的蛋白质,预测相对分子量为131.61kDa,等电点为pI4.69,为弱酸性蛋白,该基因与cry8Ea2(EU047597)基因序列同源性高达99.9%,属于第四等级新基因。通过与表达载体pET-21b连接,得到高效表达Cry8Ea蛋白的大肠杆菌菌株。再将cry8Ea基因与Bt-E.coli穿梭载体pSXY422b连接,电击转化Bt无晶体突变株HD73-,得到高效表达Cry8Ea蛋白的工程菌株BtHD8Ea,对工程菌株进行生物活性的测定,结果显示工程菌对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲有毒力,校正死亡率分别为60.46%,53.61%和39.18%。