鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因原核表达及抗原性分析

摘要

鸡传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)引起的3～12周龄雏鸡及青年鸡的一种急性、高度接触性免疫抑制传染病。其通过破坏鸡的中枢免疫器官-法氏囊,使免疫器官和免疫活性细胞功能受到严重损伤,从而出现不同的免疫抑制。该病潜伏期较短,发病率高,给我国养禽业造成巨大的经济损失。
　　 IBDV可以编码5种病毒蛋白,分别为VP1、VP2、VP3、VP4、VP5。其中VP2为主要的结构蛋白,暴露在核衣壳的外面,并携带有病毒的主要中和性抗原表位,它能诱导宿主产生针对IBDV的中和性抗体,这种抗体能保护易感鸡使其免受IBDV的感染。
　　 近年来,由于超强毒株和变异毒株的出现,导致鸡传染性法氏囊病的防治面临巨大的压力。因此,需要开发更加安全、有效的新型疫苗。
　　 本课题主要做了以下几个方面的研究:
　　 1.从辽宁省周边地区采集疑似鸡传染性法氏囊病病鸡的法氏囊组织。实验室处理后将含有传染性法氏囊病毒的上清液接种至SPF鸡胚绒毛尿囊膜,分离病毒,用琼脂免疫扩散试验进行检测,并结合动物回归试验,初步鉴定分离的毒株为鸡传染性法氏囊病毒强毒株。
　　 2.采用SPF鸡胚接种法增殖IBDV病毒,以收集的尿囊液为材料,使用Trizol试剂法提取病毒的总RNA,参照Genebank上发表的传染性法氏囊病毒VP2基因序列设计相应的引物,运用RT-PCR技术对传染性法氏囊病毒的VP2基因进行克隆和测序。将获得的VP2基因序列与Genebank中已经发表的鸡传染性法氏囊病毒毒株VP2基因序列进行比对其同源性高达99％,表明该分离毒株为鸡传染性法氏囊病毒强毒株。
　　 3.将得到的目的基因连接到pET28a原核表达载体中,得到重组质粒pET28a-VP2。经过PCR、酶切及测序分析,确定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确,与预期序列相符。再将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,使用IPTG进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及WesternBlotting分析,分子量大小约为48ku,且能与IBDV阳性血清发生特异性的免疫反应。
　　 4.将得到的融合蛋白与白油佐剂按照适当的比例进行乳化,制备基因工程亚单位疫苗。
　　 5.通过攻毒保护试验对传染性法氏囊病毒VP2蛋白基因工程亚单位疫苗的保护效力进行分析,结果表明疫苗的保护效率可以达到80%。