兔抗ES细胞免疫血清对附植前小鼠胚胎的作用

摘要

目前,四倍体胚胎补偿技术(Tbtraploid Embryos Complementation)被广泛的应用到小鼠克隆之中。但是,与同一时期的二倍体胚胎相比,四倍体胚胎的细胞数目要少一半,而且发育能力要弱。因而,我们希望制作一种没有ICM(内细胞团)的二倍体胚胎来提高这种补偿技术的效率。
　　 小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem cells,ES细胞)是从附植前内细胞团(Inner cell mass,ICM)经体外抑制分化培养而分离。收集大量的小鼠ES细胞,并将其与佐剂乳化,注射到兔子体内,收集抗血清培养小鼠附植前胚胎。有可能会抑制ICM的生长。
　　 用KSOM小鼠胚胎培养基稀释兔抗血清,分别稀释至50倍、100倍、200倍,结果显示:形态学上50倍稀释的血清能够抑制8cell胚胎的发育甚至使其死亡;100倍稀释的抗血清能够延迟8cell胚胎的致密化,并使得胚胎在囊胚化过程中出现空泡化的现象;200倍稀释的抗血清作用不明显。未作免疫处理的兔血清与空白对照组无差异。试验过程中我们发现:兔抗小鼠ES细胞血清能够阻止小鼠胚胎卵裂期的致密化,培养8h发现胚胎致密化效率降低70％;将致密化的胚胎置于抗血清中培养,胚胎会发生去致密化;延长的去致密化胚胎超过32cell后,进一步在抗血清中培养,囊胚的畸形率增加。
　　 在抗血清中持续培养之后,胚胎在囊胚化的过程中会出现两种类型的胚胎:
　　 (1)空泡化,胚胎内部没有清晰的囊胚腔,也不包含明显的ICM,而是出现数个流动性的液泡;
　　 (2)真囊胚,这类胚胎表现出正常的形态特征。
　　 将这两种类型的囊胚移植到2.5dpc的假孕母鼠体内,10天后处死,统计附植情况发现空泡化胚胎和形态正常的胚胎附植率与对照组相比都表现差异极显著(p＜0.01),但空泡化的附植率与形态正常胚胎附植率相比差异不显著(p＞0.05)。但即使是附植成功的胚胎,在第十天之前许多胎儿明显已经退化了,只留有未吸收完的组织团块,这些组织团块类似于早期的胎盘。
　　 在8cell胚胎培养到60h后,对试验组和对照组胚胎进行Hochest33342染色,计数细胞数显示,抗血清处理组细胞数显著下降(p＜0.01)。
　　 胚胎接种试验结果显示,抗血清处理后的胚胎Outgrowth的生长率显著低于对照组,且Outgrowth的形态表现得更分散、立体性不强、面积较小、边缘不够整齐。血清处理组中有极少的一部分胚胎接种后只有滋养层细胞长出,而没有ICM。
　　 对Outgrowth的碱性磷酸酶染色和胚胎多能性因子Oct4的免疫荧光染色显示,抗血清培养后的胚胎依旧存在多能性因子,即仍然有ICM的存在,但ICM的数量减少,在胚胎中的分布也明显变得无序。