农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养转化体系优化及Bar基因转化研究

摘要

大豆[Glycinemax(L.)Merrill]作为重要的油料作物和经济作物,是食用油和蛋白的主要作物来源,在食品工业和农业生产中占重要地位。随着基因工程技术的不断发展,利用转基因技术培育大豆新品种、新种质得到了广泛应用。目前,在大豆的遗传转化中农杆菌介导的子叶节转化体系存在着组织培养过程中茎伸长和生根难的问题,因此尝试建立非组织培养的大豆遗传转化体系是解决上述问题的有效途径。本研究以河北省推广的优良大豆品种为材料,以GUS基因在子叶节区的瞬时表达为依据,通过探讨影响农杆菌转化效率的多种因素,优化了大豆子叶节非组织培养遗传转化体系,并利用该体系对冀豆16号进行了Bar基因的遗传转化。通过比较叶片针刺法和涂抹法两种筛选方法的筛选效率,确立了大豆子叶节非组织培养遗传转化体系的有效筛选方法,并且通过针刺法摸索了8个河北省优良大豆品种的草铵膦筛选浓度。主要结果如下:
　　 1、通过对蔗糖浓度、表面活性剂、侵染方式、侵染次数、侵染液浓度及大豆基因型的摸索,发现侵染液中附加3％蔗糖、OD600=0.6、以脱脂棉作为菌液附着介质同时不添加表面活性剂SilwetL-77、侵染1次的GUS阳性率最高达到62.13%,冀豆16号为易感大豆基因型。
　　 2、针刺法的筛选效率为27.2%,而涂抹法的筛选效率仅为9.1%,从而确定针刺法是适合该转化体系的有效筛选方法。通过针刺法摸索了8个河北省优良大豆品种的草铵膦筛选浓度,根据叶片及植株茎尖枯焦死亡情况初步确定其草铵膦筛选浓度分别为:冀豆15号、五星2号为100mg/L;冀豆16号、冀豆17号、五星1号、中黄13号为150mg/L;冀豆7号、nf58为200mg/L。
　　 3、利用优化的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系对河北省优良大豆品种冀豆16号进行了Bar基因的遗传转化,植株再生率达71.2%,草铵膦抗性植株经PCR检测获得T0代阳性植株10个,转化率为2.5%。经PCR和RT-PCR鉴定共获得3株T1代阳性植株,初步证明目的基因已整合到大豆基因组中。