蒺藜皂苷对奶牛瘤胃发酵、甲烷产量、抗氧化功能及免疫功能的影响

摘要

瘤胃甲烷的产生不仅导致饲料能量的损失，而且还会促使全球气候变暖。随着全球对温室气体排放的重视，有关减缓反刍动物甲烷排放的瘤胃调控技术方面的研究受到越来越多的关注。本课题选用从蒺藜科植物蒺藜中提取的蒺藜皂苷(GSTT)作为试验材料，通过瘤胃体外发酵产气试验、双外流连续培养试验和奶牛饲养试验，系统研究GSTT对奶牛瘤胃发酵、甲烷产量、营养物质消化代谢及其抗氧化能力和免疫功能的影响，并利用荧光定量PCR技术分析检测瘤胃微生态主要菌群的变化，对GSTT减少甲烷产生的机理进行探讨。
　　 试验一本试验采用Mneke的Syrnige系统研究GSTT对体外发酵特性和甲烷产量的影响。试验设五个处理水平，GSTT添加量分别为0，0.15，0.30，0.60和0.90 g/L，每个处理设四个重复，同时设一个空白对照组。在此培养系统中，瘤胃培养液用量为30 mL，培养底物为200 mg玉米粉和羊草粉等量混合物。结果表明，体外培养24h后，除0.15g/L GSTT处理组外，其余处理组体外甲烷浓度和产量较对照组均显著降低(P＜0.05)，0.30，0.60和0.90 g/L GSTT处理组甲烷产量分别降低26.67％，28.89％，31.11％(P＜0.05)。添加GSTT对pH和挥发性脂肪酸(VFA)浓度无显著影响(P＞0.05)，但随着GSTT添加水平的增加，氨态氮(NH3-N)的浓度降低(P＜0.05)，丙酸摩尔百分比升高(P＜0.05)，乙酸、丁酸摩尔百分比和乙酸/丙酸(A/P)值降低(P＜0.05)。体外发酵24h后，GSTT降低了瘤胃体外培养液中原虫的数量(P＜0.05)，且随着GSTT添加水平的增加呈线性降低(P＜0.01)。0.15，0.30，0.60和0.90 g/L GSTT处理组原虫数量较对照组分别降低27.03％，37.84％，60.36％和72.07％。与对照组相比，较低剂量GSTT处理组体外干物质消失率(IVDDM)无显著变化（P＞0.05），但高剂量GSTT处理组(0.60和0.90 g/L)显著降低(P＜0.05)。
　　 试验二本试验旨在探讨利用ANKOM RFS气体测量系统研究瘤胃体外发酵的可行性，并进一步研究GSTT对体外瘤胃发酵、甲烷产量和微生物区系的影响。试验设五个处理水平，GSTT添加量分别为0，0.15，0.30，0.60和0.90 g/L，每个处理设四个重复，同时设一个空白对照组。在此培养系统中，瘤胃培养液用量为100 mL，培养底物由340 g/kg玉米、160 g/kg豆粕和500 g/kg羊草草粉组成。结果表明，在任一培养时间点，随着GSTT添加水平的升高，体外甲烷排放量呈线性降低(P＜0.01)。体外培养24h时，添加0.15，0.30，0.60和0.90 g/L GSTT处理组甲烷产量较对照组分别降低8.72％(P＞0.05),15.44％(P＜0.05),21.48％(P＜0.05)和24.16％(P＜0.05)。添加GSTT对pH和VFA的浓度没有显著影响(P＞0.05)。发酵模式发生改变，随着GSTT添加水平的增加，丙酸摩尔百分比升高，乙酸摩尔百分比和A/P值降低，NH3-N浓度下降。GSTT降低了瘤胃体外培养液中原虫相对于总菌(16S rDNA)的数量(P＜0.05)，且随着GSTT添加水平的提高呈线性和二次曲线规律降低(P＜0.01)。甲烷菌和真菌相对于总菌(16S rDNA)的数量随着GSTT添加水平的提高呈线性降低(P＜0.01)。GSTT对产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌相对于总菌(16S rDNA)的数量无显著影响（P＞0.05）。总体面言，GSTT对体外产气量，甲烷产量以及发酵特性的影响在Mneke的Syrnige系统和ANKOM RFS气体测量系统中的趋势基本一致，说明ANKOM RFS系统可以模拟瘤胃用以研究体外发酵。
　　 试验三本试验旨在利用DFCOS-Ⅱ型双外流连续培养系统，进一步研究日粮中添加不同浓度的GSTT对奶牛瘤胃发酵特性的影响，进而筛选适宜剂量或范围，为后续体内试验研究提供参考依据。试验设四个处理水平，GSTT添加量分别为0，0.15，0.30和0.60 g/L，每个处理设三个重复，试验周期为7d，前5d为适应稳定期，最后2d为采样期。结果显示，日粮添加不同水平GSTT对瘤胃pH、总VFA浓度无显著影响(P＞0.05);随着GSTT添加水平的提高，人工瘤胃液NH3-N浓度、乙酸摩尔百分比和A/P值降低(P＜0.05)，丙酸摩尔百分比升高(P＜0.05)。提示，GSTT可望作为一种反刍动物瘤胃发酵调控剂来改变瘤胃发酵模式，改善对饲料能量和蛋白质的利用效率。
　　 试验四本试验以健康瘘管奶牛为试验动物，进行4×4拉丁方试验，共4期，每期28d。研究GSTT对奶牛瘤胃微生物发酵、甲烷产量、营养物质消化代谢及其抗氧化能力和免疫功能的影响，以验证其实际应用效果。根据体外试验结果，确定4个处理组中GSTT的添加水平分别为每天0g（对照组），59，10g，15g。研究结果表明:(1)日粮中添加不同水平的GSTT对奶牛DMI、瘤胃液pH和总VFA的浓度均无显著影响(P＞0.05)。添加10g/d和15 g/dGSTT处理组奶牛甲烷排放量较对照组显著降低(P＜0.05)，但两处理组之间差异不显著(P＞0.05)。若以奶牛每千克干物质采食量所排出的甲烷产量来计，添加10g/d GSTT处理组最低(14.94 g/kg DMI)。与对照组相比，10g/d和15 g/d GSTT处理组奶牛瘤胃液NH3-N浓度降低(P＜0.05)，丙酸摩尔百分比升高(P＜0.05)，A/P值降低(P＜0.05)。GSTT对奶牛瘤胃内原虫数量有显著影响，10g/d和15g/d GSTT处理组低于对照组(P＜0.05)。奶牛瘤胃液中真菌和甲烷菌的数量随GSTT添加量的增加均呈线性降低趋势，但各处理组之间差异均不显著(P＞0.05)。日粮中添加GSTT对奶牛瘤胃液中产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的数量没有显著影响（P＞0.05）。
　　 (2)日粮中添加不同水平的GSTT对DM在奶牛瘤胃内的降解率及其有效降解率均无显著影响(P＞0.05)，但其有效降解率有降低趋势。GSTT对36 h、48 h时CP的瘤胃降解率及其有效降解率均有不同程度影响，以15 g/d GSTT处理组最低，显著低于对照组(P＜0.05)。GSTT对奶牛NDF和ADF瘤胃有效降解率均无显著影响(P＞0.05)。GSTT对奶牛DM、OM、GE、CP、NDF和ADF的全消化道表观消化率亦无显著影响(P＞0.05)。各处理组之间奶牛瘤胃滤纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶和水杨苷酶的活性均无显著差异(P＞0.05)，但15 g/d GSTT处理组奶牛瘤胃木聚糖酶活性较对照组显著降低(P＜0.05)。
　　 (3)日粮中添加GSTT对奶牛血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的浓度和白球比(A/G)均无显著影响(P＞0.05)，但血清TP浓度随GSTT添加水平的增加有升高的趋势(P=0.09)。日粮中添加GSTT可显著降低奶牛血清尿素氮(SUN)(P＜0.05)、甘油三酯(TG)(P＜0.01)和总胆固醇(TC)(P＜0.05)的浓度。奶牛血清中高密度胆固醇(HDL-C)的浓度随GSTT添加量的增加呈线性提高（P=0.03），但各处理组之间差异未达显著水平(P＞0.05)。添加GSTT对奶牛血清中谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)活性和碱性磷酸酶(ALP)的活性及其肌酐、葡萄糖、钙和磷的浓度均无显著影响(P＞0.05)。
　　 (4)与对照组相比，10 g/d和15 g/d GSTT处理组奶牛血清总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P＜0.05)，血清丙二醛(MDA)水平显著降低(P＜0.05)，但两处理组之间差异不显著(P＞0.05)。奶牛血清超氧化物歧化酶(SOD)活性随着GSTT添加剂量的提高有升高趋势(P=0.06)。由此可见，日粮中添加GSTT对奶牛的抗氧化能力有一定的改善作用。
　　 (5)日粮中添加GSTT对奶牛血清IgA、白介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-a)含量均无显著影响(P＞0.05)，但10g/d和15g/dGSTT处理组奶牛血清IgG、IgM的含量较对照组显著提高(P＜0.05)。随着GSTT添加剂量的增加，奶牛血清中IgA含量和IL-2的水平亦呈线性升高趋势（P=0.05）。提示GSTT对奶牛的免疫功能有一定的改善作用。
　　 综上所述，添加适量GSTT对奶牛瘤胃发酵具有调控作用，可去除部分瘤胃原虫，适度降低瘤胃液NH3-N的浓度，抑制奶牛甲烷的生成，并对奶牛的抗氧化能力和免疫功能具有一定的改善作用。综合考虑，在本试验条件下，日粮中GSTT适宜添加量为10 g/d。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 引言

第一节 瘤胃甲烷的生成及其调控

1 瘤胃甲烷的产生机制

2 瘤胃甲烷菌及其与其他微生物的关系

3 测定瘤胃甲烷产量的方法

4 影响瘤胃甲烷产生的因素

5 降低瘤胃内甲烷生成的调控措施

第二节 皂苷研究进展

1 皂苷的化学结构、分布和存在形式

2 皂苷的提取和分离

3 皂苷的生物活性

4 皂苷在单胃动物生产中的应用

5 皂苷在反刍动物生产中的应用

第三节 GSTT生物学特性

1 化学成分

2 GSTT的药理作用

第四节 瘤胃微生物的定量研究方法

1 rRNA／rDNA序列分析技术

2 宏基因组学技术

第五节 本研究的目的意义及主要内容

1 研究目的和意义

2 研究的主要内容

第二章 短期体外批次培养系统研究GSTT对瘤胃发酵和甲烷产量的影响

第一节 Symige系统研究GSTT对发酵特性和甲烷产量的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二节 ANKOM RFS气体测量系统研究GSTT对体外微生物发酵和甲烷产量的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三章 双外流连续培养系统研究GSTT对奶牛瘤胃发酵功能的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 样品收集与检测

1．4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 不同浓度GSTT对人工瘤胃发酵液中pH、NH3-N和VFA浓度的影响

2．2 不同浓度GSTT对人工瘤胃发酵液pH的动态影响

2．3 不同浓度GSTT对人工瘤胃发酵液NH3-N的动态影响

2．4 不同浓度GSTT对人工瘤胃发酵液VFA的动态影响

3 讨论

4 小结

第四章 GSTT对奶牛甲烷产量、瘤胃发酵、营养物质消化及血液指标的影响

第一节 GSTT对奶牛甲烷产量和瘤胃发酵功能的影响

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二节 日粮中添加不同水平GSTT对奶牛营养物质消化代谢的影响

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三节 日粮中添加不同水平GSTT对奶牛瘤胃内纤维素酶活性的影响

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四节 日粮中添加不同水平GSTT对奶牛血液生化指标、抗氧化能力及免疫功能的影响

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第五章 结论和建议

1 本研究的主要结论

2 本研究的创新点

3 有待于进一步研究的问题

附录 微生物纤维素类酶活性的测定(DNS法)

参考文献

在读博士期间发表的论文

作者简介

致谢