乳酸菌融合表达载体的构建及α-淀粉酶基因的克隆与表达

摘要

乳酸菌作为一种重要的工业微生物，已经被广泛应用到了畜牧、食品、医药等众多行业，是目前最常用的益生菌。随着对乳酸菌生理生化等研究的深入，人们更加迫切的想要揭示乳酸菌在人和动物体内定植、分布、存活及其益生特性的活性机理，这就需要借助分子生物学的手段来构建具有指示作用的工程菌株。红色荧光蛋白dsred2基因是一种堪称完美的荧光标记分子，其成熟后可以不用荧光激发，用肉眼在日光下就可以检测到鲜艳的红色。用红色荧光蛋白基因标记乳酸菌及其蛋白然后进行跟踪观察，可以帮助研究乳酸菌的一些生理机制及功能基因的作用。
　　 本研究在大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pMG36e的基础上，构建了以红色荧光蛋白基因为标记的乳酸菌融合表达系统pMG36e-dsred2，并以α-淀粉酶(amy)为报告基因实现了融合基因dsred2-amy在乳酸菌内的融合表达。研究得到以下结果:
　　 根据Genebank上公布的dsred2基因序列，设计合成引物，并在引物上、下游分别添加XbaⅠ与HindⅢ两酶切位点，然后以质粒pPIC9k-dsred2为模板扩增得到dsred2基因的全部编码区序列，并将其连接到克隆型载体pMD19-T上。用XbaⅠ、HindⅢ同时双酶切载体pMG36e与pMD19-T，回收线性pMG36e和小片段dsred2，然后将二者用T4连接酶连接转化大肠杆菌，得到重组载体pMG36e-dsred2。
　　 以地衣芽孢杆菌基因组为模板，根据Genebank上公布的amy基因序列设计引物，在引物上下游分别添加SacⅠ与XbaⅠ两酶切位点，扩增只带有起始密码子不带有终止密码子的α-淀粉酶基因，将其连接到克隆型载体pEASY-T1。然后用SacⅠ、XbaⅠ两限制性内切酶同时双酶切载体pMG36e-dsred2与pEASY-T1-amy，回收amy片段与线性pMG36e-dsred2，之后用T4连接酶将二者连接使amy基因与dsred2融合，得到dsred2与amy基因融合的表达载体pMG36e-dsred2-amy。最后将该载体电转化干酪乳杆菌，检测重组蛋白活性。
　　 研究发现红色荧光蛋白基因dsred2与融合基因dsred2-amy均能够在大肠杆菌及乳酸菌中表达。红色荧光蛋白基因在pMD19-T上有红色荧光，其强度比pMG36e载体上的鲜艳;融合蛋白在大肠杆菌和乳酸菌分别具有dsred2、amy基因活性，表达强度在融合前后没有明显差别。SDS-PAGE凝胶电泳分析证实dsred2基因与amy基因融合成功，dsred2蛋白分子量为24.8 kDa，融合蛋白dsred2-amy的分子量为81.5 kDa。
　　 本研究成功构建了乳酸菌融合表达载体pMG36e-dsred2，检测了其在大肠杆菌及乳酸菌中的荧光活性;然后以α-淀粉酶基因作为报告基因，分析了该载体的融合表达活性。为乳酸菌在生物体内的定植、分布、存活等的进一步研究提供了方法，也为研究外源蛋白在乳酸菌内的表达的分泌（细胞内、细胞壁、细胞外表达）、活性检测等奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 乳酸菌研究现状

1．1．1 乳酸菌在饲料行业的应用

1．1．2 乳酸菌在食品行业的应用

1．1．3 乳酸菌在医疗保健行业的应用

1．1．4 乳酸菌在微生态制剂行业的应用

1．1．5 乳酸菌在人工口服疫苗行业的应用

1．2 外源基因在乳酸菌中的表达

1．2．1 胞内表达

1．2．2 胞外表达

1．2．3 胞壁表达

1．3 融合表达载体

1．3．1 为蛋白纯化提供亲和标签的融合表达载体

1．3．2 提高蛋白可溶性的融合载体

1．3．3 报告基因检测系统

1．4 红色荧光蛋白

1．4．1 红色荧光蛋白的理化性质

1．4．2 红色荧光蛋白的修饰改进

1．4．3 红色荧光蛋白的应用

1．5 淀粉酶基因

1．6 技术路线图

2 材料与方法

2．1 菌种

2．2 培养基

2．3 主要试剂

2．3．1 常规生化试剂

2．3．2 分子生物学试剂

2．4 主要仪器设备

2．5 引物设计

2．6 试验试剂及药品的配置

2．7 试验方法

2．7．1 dsred2基因的克隆

2．7．2 dsred2基因克隆到pMG36e载体

2．7．3 pMG36e-dsred2电转化干酪乳杆菌

2．7．4 α-淀粉酶基因的克隆

2．7．5 amy基因克隆到pMG36-dsred2载体

2．7．6 pMG36e-dsred2-amy电转化干酪乳杆菌

2．7．7 融合表达载体表达活性检测

3 结果与分析

3．1 dsred2基因的克隆

3．1．1 质粒pPIC9k-dsred2的提取

3．1．2 dsred2基因克隆到T载体

3．2 dsred2基因克隆到pMG36e载体

3．3 amy基因的克隆

3．3．1 提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA

3．3．2 amy基因克隆到T载体

3．3．3 α-淀粉酶基因克隆到载体pMG36-dsred2

3．3．4 pMG36-dsred2-amy电转化乳酸菌

3．4 融合表达载体表达活性检测

3．4．1 荧光检测

3．4．2 淀粉酶活性检测

3．4．3 SDS-PAGE蛋白电泳检测

4 讨论

4．1 乳酸菌融合表达系统

4．2 引物设计

4．3 红的荧光蛋白dsred基因的表达

4．3．1 红色荧光蛋白基因在载体pMD19-T上的表达

4．3．2 红色荧光蛋白在载体pMG36e上的表达

4．4 amy基因的表达

4．5 融合基因的表达

5 结论

展望

参考文献

附录1 碱裂解法提取质粒

附录2 PCR产物的纯化

附录3 重组载体热击转化大肠杆菌

附录4 dsred2基因测序结果

附录5 amy基因测序结果

在校期间发表的学术论文

作者简介

致谢