褪黑素和热应激对小鼠精子质量和胚胎发育的影响

摘要

本实验以ICR公鼠为受试动物，检测三种不同的热应激程度(37.30℃，22d;36.32℃，12d和35.78℃，20d)对公鼠的精子质量以及早期胚胎发育的损伤情况，以及用饮水和注射两种方式添加褪黑素后对热应激损伤是否有所缓解。试验分为四个组:常温组（C组）、常温加褪黑素组（CM组）、热应激组（H组）、热应激加褪黑素组（HM组）。热应激结束后记录了四个组每只公鼠的体重和睾丸重、精子密度、活力、顶体完整性、膜完整性并观察睾丸组织形态变化。各组公鼠均和正常母鼠交配后记录了受精率、卵裂率、四细胞发育率、八细胞发育率、桑葚胚率、囊胚率以及囊胚细胞数和凋亡数。
　　 试验一条件为最高温度37.30℃、热应激时间22天，饮水添加褪黑素。热应激组和对照组相比精子密度、活力明显下降，尤其活力由46.76％降低至0.71％。睾丸重以及睾丸指数差异极显著(p＜0.01)，体重差异不显著。对照组和热应激组分别在饮水中添加浓度为0.1mg/ml褪黑素，精子密度、活力和睾丸指数均没有改善。
　　 试验二最高温度由37.30℃降低为36.32℃，热应激时间由22天减少为12天。虽然精子密度、活力以及睾丸指数等差异仍显著，但是热应激程度明显下降，热应激组精子活力和密度为对照组的60.67％和51.31％。对照组和热应激组分别在饮水中添加浓度为0.1mg/ml褪黑素，精子密度、活力和睾丸指数仍旧没有明显改善。
　　 试验三最高温度由37.30℃降低为35.78℃，最高温度降低1.5℃，热应激时间为20天。受到热应激后，精子密度、顶体完整性、膜完整性和对照组相比，差异均显著，睾丸重及睾丸指数差异极显著(p＜0.01)。热应激组睾丸组织生精上皮细胞数量明显减少，排列疏松，生成的精子数量减少，曲精细管可见空泡。此次采用腹膜注射的方式添加褪黑素，浓度为10mg/kg，对精子质量和睾丸形态仍没有作用。热应激公鼠和正常母鼠交配后，受精率和各个阶段的早期胚胎发育率均受到影响，明显下降，添加褪黑素后，虽受精率、胚胎发育率和热应激组相比仍差异不显著，但是有明显数值上的改善。热应激添加褪黑素组受精率和热应激组受精率分别为70.15％和61.82％。添加褪黑素后卵裂到囊胚的早期胚胎发育率和热应激组相比均提高了13.54％、11.43％、11.33％、15.92％、9.33％。热应激组和对照组囊胚细胞数差异显著(54.56vs38.61，p＜0.05)，囊胚凋亡数差异显著(6.83％.vs11.82％，p＜0.05)，热应激组和热应激添加褪黑素组的囊胚细胞数和凋亡数差异亦显著(38.61vs.49.37，p＜0.05和11.82％vs.5.57％，p＜0.05)。说明添加褪黑素没有改善精子表型，但是明显改善了热应激公鼠精子DNA损伤，使得形成的受精率和胚胎发育率明显升高，尤其是显著改善了囊胚质量。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 热应激

1．1．1 活性氧和精子损伤

1．1．2 抗氧化剂对精子损伤的防御

1．2 精子损伤和胚胎发育

1．2．1 精子发生过程

1．2．2 精子常规指标的检测

1．2．3 精子DNA损伤和胚胎发育

1．3 褪黑素

1．3．1 褪黑素概述

1．3．2 褪黑激素的体内合成和代谢

1．3．3 褪黑素的抗氧化作用

1．3．4 褪黑素受体

1．3．5 褪黑素的安全性

1．4 本实验的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验设备和耗材

2．1．2 实验试剂和药品

2．1．3 主要试剂的配置

2．2 实验动物

2．3 试验方法

2．3．1 褪黑素的配置

2．3．2 人工气候箱环境检测

2．3．3 精子密度和活力的测定

2．3．4 体重和睾丸重以及睾丸指数的测定

2．3．5 小鼠精子质膜完整性检测(低渗膨胀试验)

2．3．6 小鼠精子顶体完整性的检测

2．3．7 早期胚胎培养

2．3．8 囊胚凋亡染色(TUNEL检测)

2．5．9 石蜡切片的制备

2．5．10 HE染色步骤

2．4 实验设计

2．5 数据分析

3．结果与分析

3．1 褪黑素和热应激对小鼠精子质量的影响

3．2 褪黑素和热应激对小鼠体重和睾丸重及指数的影响

3．3 褪黑素和热应激对小鼠睾丸组织形态的影响

3．4 褪黑素和热应激对受精率的影响

3．5 褪黑素和热应激对胚胎早期发育的影响

3．6 褪黑素和热应激对囊胚细胞数和凋亡的影响

4 讨论

4．1 热应激温湿度的确定

4．2 热应激对精子质量和胚胎发育的影响

4．3 热应激对小鼠体重和睾丸重的影晌

4．4 热应激对睾丸组织形态的影响

4．5 褪黑素的添加方式和计量

4．6 褪黑素对公鼠精子质量和胚胎发育的缓解作用

5．结论

参考文献

在读期间发表论文情况

作者简历

致谢