黄花蒿EβF合成酶基因及麦长管蚜蜕皮素受体基因USP和EcR的克隆和遗传转化

摘要

麦蚜是小麦生产中的主要害虫，蚜虫危害还能传播各种病毒病，造成小麦减产和品质下降。本研究利用已经分离克隆到的黄花蒿(Artemisia annua)的[反]-β-法尼烯（EβF）合成酶基因，构建农杆菌表达载体，并通过农杆菌介导法获得转基因小麦。此外分离克隆了麦长管蚜蜕皮素受体基因(EcR)和超气门蛋白基因(USP)，合成上述基因dsRNA后进一步饲喂蚜虫，研究了RNAi干涉上述基因的效果及构建干扰上述基因载体转化小麦，实现小麦抗蚜的可行性。主要研究结果如下:
　　1.利用实验室已经克隆到的黄花蒿EβF合成酶基因(HHH)，采用DNA重组技术构建了融合该基因的双元表达载体185 HHH-167 Bar。
　　2.以六倍体小麦KN199为受体材料，采用农杆菌介导小麦幼胚的遗传转化技术，建立了表达EβF合成酶基因（HHH）的7个转基因株系，分别为K01-1-1、K01-3-5、K01-1-6、K02-1-4、K02-5-4、KHH-1-5和KH-5。上述株系均具有Bar抗性。另获得未检测到EβF合成酶基因（HHH）但Bar基因呈阳性的5个株系，分别为K01-3-6、K02-2-5、K02-3-4、K03-1-1和K06-3-4。以获得的EβF合成酶转基因株系为材料，对HHH的功能和表达特性进行了分析，为进一步分析转基因植株蚜虫趋避特性及供试基因对天敌的影响奠定了基础。
　　3.根据序列保守区设计基因扩增特异引物，克隆了麦长管蚜蜕皮素受体基因EcR和超气门蛋白基因USP。以麦长管蚜的cDNA为模板，使用体外转录试剂盒合成了上述基因的dsRNA。
　　4.利用合成的EcR和USP的dsRNA进行了蚜虫饲喂和抗蚜研究，期间以饲喂干扰蚜虫生长发育导致蚜虫生殖死亡的唾液腺表达基因COO2和饲喂绿色荧光蛋白基因GFP分别作阳性和阴性对照。结果表明，饲喂7.5 ng/μLEcR和USP dsRNA浓度抗蚜效果显著，诱发的蚜虫死亡率与喂食COO2的效果相当。表明EcR和USP具有显著的抗蚜效果。
　　5.用EcR和USP dsRNA人工饲料饲喂麦长管蚜2d、4d、6d和8d后，采用q-RT PCR技术，对饲喂后麦长管蚜的USP、EcR和COO2表达水平进行了分析。结果表明，饲喂后的麦长管蚜体内上述基因的表达水平均明显下调，与饲喂后诱发蚜虫的死亡率增大结果相对应。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1 引言

1．1 麦蚜的危害和防治

1．1．1 麦蚜的发生特点

1．1．2 麦蚜对小麦的危害

1．1．3 麦蚜的防治方法

1．2 植物萜类代谢和EβF

1．2．1 植物萜类代谢概述

1．2．2 EβF

1．3 RNA干扰的原理和研究现状

1．3．1 RNAi的原理

1．3．2 RNAi的研究现状

1．4 蚜虫蜕皮激素

1．4．1 蜕皮激素概述

1．4．2 蜕皮激素受体的结构和功能

1．4．3 蜕皮激素与受体的作用方式

1．5 本研究的目的和意义

2 黄花蒿EpF合成酶转基因小麦研究

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体

2．1．3 试剂和耗材

2．1．4 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 载体构建

2．2．2 农杆菌的活化和制备

2．2．3 小麦遗传转化

2．2．4 转基因小麦鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 载体pClean-G185-Ubi-CTP-HHH-Nos的鉴定

2．3．2 农杆菌活化和检测

2．3．3 小麦遗传转化

2．3．4 转基因植株阳性检测

2．4 讨论

2．4．1 小麦遗传转化的方法和效率

2．4．2 EβF合成酶基因的选择

3 麦长管蚜蜕皮素受体USP和EcR的RNAi研究

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 蚜虫

3．1．3 质粒

3．1．4 常用试剂

3．1．5 蚜虫营养液

3．2 实验方法

3．2．1 蜕皮素受体基因EcR和USP的克隆及鉴定

3．2．2 dsRNA合成

3．2．3 dsRNA纯化

3．2．4 dsRNA饲喂蚜虫试验

3．2．5 总RNA提取

3．2．6 RT-PCR

3．2．7 qRT-PCR

3．3 结果与分析

3．3．1 麦长管蚜USP和EcR基因的克隆

3．3．2 麦长管蚜USP和EcR dsRNA合成及纯化

3．3．3 蚜虫死亡率分析

3．3．4 qRT-PCR分析

3．4 讨论

3．4．1 蚜虫的接种和饲喂

3．4．2 dsRNA在蚜虫体内的传递

3．4．3 dsRNA导入蚜虫体内的方法

3．4．4 EcR和USP介导的信号传导

4 结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢