RNA干扰对绵羊抑制素α亚基基因(INHA)表达的抑制效果

摘要

抑制素(inhibin，INH)是由绵羊的卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞分泌的糖蛋白质激素，它是由一个α亚基和一个β亚基通过二硫键构成的，其中抑制素α亚基（INHA）是抑制素发挥生理功能必不可少的。抑制素能抑制雌性动物促卵泡素(FSH)的释放，调节卵泡的生成;对雄性动物表现为抑制精子的发生，降低睾丸的生精能力。可见，可通过抑制抑制素α亚基基因的表达，来降低动物体内的抑制素水平，从而促进卵泡发育和精子的生成，继而提高动物的繁殖力。
　　RNA干扰技术是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默技术，具有高度的特异性。然而，根据以前的研究报告显示shRNA表达载体只能转录生成一种特异性的小干扰RNA，来阻断单一靶点的表达，干扰效率比较低。
　　为了提高shRNA的干扰效率，我们在一个载体上插入两个靶点shRNA表达序列，即构建含有双启动子的shRNA表达载体，并将其与单个靶点shRNA载体的干扰效率作比较。本研究利用RNA干扰技术，根据绵羊INHA基因的cDNA序列设计构建shRNA重组质粒，通过双重PCR方法扩增启动子序列，构建含有U6和H1双启动子的不同靶特异干扰序列shRNA表达载体pGenesil1.2-INHA1+2，单个靶特异性序列的单启动子表达载体pGenesil1.2-INHA以及不针对任何序列的阴性对照重组质粒pGenesil1.2-HK。用lip2000将阴性对照、pGenesil1.2-INHA、pGenesil1.2-INHA1+2分别转染到绵羊的卵泡颗粒细胞中，用荧光定量PCR的相对定量法来检测转染了48小时后，各样品瞬时转染后基因的表达量，计算干扰的效果。western blot检测转染细胞INHA的蛋白表达情况。
　　结果如下:
　　1.酶切结果显示，试验成功的构建了双启动子shRNA表达载体pGenesil1.2-INHA1+2和单启动子表达载体pGenesil1.2-INHA。
　　2.各重组质粒表达载体转染绵羊卵泡的颗粒细胞，瞬时转染48h荧光定量PCR检测结果显示，实验组与对照组相比，构建的shRNA表达载体pGenesil1.2-INHA，pGenesil1.2-INHA1+2对INHA基因都有抑制作用，其中双启动子表达载体pGenesil1.2-INHA1+2抑制效率较高，基因沉默达到83％。
　　3.western blot检测结果显示，在干扰作用下，细胞中蛋白的表达与空白对照组和阴性对照组相比明显减少，与对照组相比，实验组pGenesil1.2-INHA，pGenesil1.2-INHA1+2细胞中INHA荧光蛋白的表达量都有降低，而这两组相比，pGenesil1.2-INHA1+2的荧光蛋白表达量降低更加明显。
　　结论:
　　综上所述，双启动子shRNA载体转染卵泡的颗粒细胞后，可显著降低INHA基因mRNA与蛋白的表达，相比单个靶特异性序列的单启动子shRNA载体有更高的抑制效率。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

1 引言

1．1 抑制素的研究进展

1．1．1 抑制素的来源

1．1．2 抑制紊的分子结构

1．1．3 抑制素的生理作用

1．1．4 抑制素在动物繁殖上的应用

2．1 RNA干扰的发展史

2．1．1 RNAi的分子生物学机制和特点

2．1．2 siRNA的制备方法

2．1．3 shRNA的设计原则

3．1 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 载体与菌株

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液配制

2．1．5 主要分子生物学分析工具

2．2 方法

2．2．1 INHA基因的生物信息学分析

2．2．2 shRNA重组质粒的构建

2．2．3 质粒的无内毒素大量提取和浓度测定

2．2．4 绵羊颗粒细胞的培养及重组质粒的转染

2．2．5 通过qPCR方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果

2．2．6 Western-blot检测干扰基因的蛋白表达量

3 结果与分析

3．1 生物信息学分析

3．1．1 绵羊INHA系统进化树

3．1．2 绵羊INHA蛋白的理化性质的分析

3．1．3 绵羊INHA蛋白的一级结构

3．1．4 绵羊INHA蛋白的二级结构

3．1．5 绵羊INHA蛋白的信号肽

3．1．6 绵羊INHA蛋白亚细胞定位

3．1．7 绵羊INHA蛋白的跨膜结构分析

3．1．8 绵羊INHA蛋白三级结构

3．2 重组质粒的鉴定

3．2．1 靶向INHA基因单启动子shRNA表达载体的酶切鉴定结果

3．2．2 靶向INHA基因双启动子shRNA表达载体的酶切鉴定结果

3．3 实时荧光定量PCR法检测细胞内目的基因mRNA表达量

3．3．1 管家基因GAPDH和目的基因INHA扩增曲线和熔解曲线

3．3．2 内参定量结果

3．3．3 目的基因定量结果

3．4 Western-blot检测蛋白表达量

4 讨论

4．1 RNA干扰及U6／H1双启动子表达载体的体外构建

4．1．1 关于RNAi与siRNA靶位点的选择

4．1．2 制备siRNA方法的选用

4．1．3 双启动子shRNA表达载体的构建思路

4．1．4 转染方法的选择和影响转染实验的因素

4．2 双启动子shRNA表达载体的研究展望

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢