外源重组Wnt3a蛋白对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞数量及分泌活性影响的研究

摘要

奶牛的乳腺组织具有合成及分泌乳汁的特殊功能，而这一功能是由乳腺上皮细胞来完成的，上皮细胞的数量及其分泌活性直接影响到奶牛的产奶量。奶牛的乳腺组织具有重塑的功能，伴随着泌乳周期周而复始的变化，不断的进行退化和重塑。如果在乳腺组织重塑的过程中，能够使具有泌乳功能的上皮细胞的数量在有限的空间内增加更多，活性更强，那么对乳产量具有重要的意义。有研究证明成年小鼠乳腺中含有对Wnt蛋白敏感的细胞群，这一细胞群中含有丰富的乳腺干细胞，并证实了Wnt3a蛋白对乳腺干细胞集落的形成有明显的促进作用，维持了其形成功能性腺体的功能。推测，Wnt通路的激活可以促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖。
　　本实验以健康奶牛乳腺组织为原材料，组织块培养方法进行细胞培养，用倒置显微镜对培养的细胞进行观察。结果发现，组织块培养至3-4天有成纤维细胞长出，6天左右有鹅卵石样和铺路石样上皮细胞长出，细胞核大而明显，有2至4个核仁，细胞间隔紧密。
　　细胞培养液中β-酪蛋白提取方法的改进。因所培养的细胞为原代单层贴壁细胞，细胞数量有限，故培养液中上皮细胞分泌物的量很少，不易检测。本实验中采用了四种蛋白提取方法对细胞培养液中的β-酪蛋白进行提取，并结合western-blot方法对提取液进行鉴定，获得了操作简单，经济实用，切实可行的提取方法，即物理沉淀法。同时证明了所获得的乳腺上皮细胞具有正常分泌功能。从而，初步建立了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系。
　　在组织块培养48h进行第一次换液时，细胞培养液中添加不同浓度(10ng/mL、25ng/mL和50ng/mL)的外源性重组Wnt3a蛋白。选取各组培养至7-11天的细胞（各两个重复），用酶消化法纯化细胞，所得细胞进行计数，绘制细胞生长曲线。收集10-12天的细胞培养液，用Western-blot方法检测培养至10-12天的细胞培养液中β-酪蛋白的分泌量。与此同时，待收集细胞培养液后，用酶消化法消化三次去除成纤维细胞，得到纯化的上皮细胞，提取上皮细胞中总RNA，采用荧光定量PCR方法对Wnt/β-catenin信号通路中Frizzled1受体和β-catenin的mRNA表达进行了测定。三组中Frizzled1受体mRNA相对表达量分别为0.79、1.13和1.89，β-catenin的mRNA相对表达量分别为0.44、0.91和1.19。
　　结论:初步建立了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系，成功摸索出β-酪蛋白的提取方法;50ng/mL的Wnt3a为本实验中刺激乳腺上皮细胞的最适宜浓度，上皮细胞的数量和β-酪蛋白的分泌量明显较高于其他各组。Wnt经典信号通路中受体Frizzled1受体mRNA表达量明显增多，β-catenin mRNA表达量未见明显变化。

目录

声明

论文说明

摘要

缩写词表

1 引言

1．1 奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究现状

1．1．1 奶牛乳腺上皮细胞体外培养的意义

1．1．2 乳腺上皮细胞原代培养的研究概况

1．1．3 细胞培养添加物

1．1．4 乳腺上皮细胞分泌功能鉴定的研究概况

1．2 Wnt信号通路概述

1．2．1 经典的Wnt信号传导通路

1．2．2 卷曲蛋白受体的研究进展

1．2．3 β-catenin的研究进展

1．2．4 经典的Wnt信号传导通路中其他成分

1．3 本课题研究意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验用动物组织

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养

2．2．2 乳腺上皮细胞分泌功能的鉴定

2．2．3 Wnt3a蛋白对乳腺上皮细胞数量及分泌活性的影响

2．2．4 Frizzled1受体和β-catenin在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

3 结果

3．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养

3．2 细胞培养液中β-酪蛋白的提取及鉴定

3．3 Wnt3a蛋白对奶牛乳腺上皮细胞数量的影响

3．4 Wnt3a蛋白对奶牛乳腺上皮细胞活性的影响

3．5 荧光定量PCR检测结果

3．5．1 RT-PCR扩增结果

3．5．2 质粒PCR检测结果

3．5．3 标准曲线建立结果

3．5．4 Frizzled1受体和β-catenin荧光定量PCR结果

4 讨论

4．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养

4．2 乳腺上皮细胞的鉴定

4．3 Wnt3a蛋白对奶牛乳腺上皮细胞数量及泌乳活性的影响

4．4 Wnt3a蛋白对奶牛乳腺上皮细胞的FZD1受体和β-catenin表达量的影响

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢