月季花器官发育基因AGAMOUS对低温导致花朵过度重瓣化的作用研究

摘要

月季(Rosa hybrida)是世界四大切花之一，具有很高的观赏价值。低温是导致切花月季花瓣过度重瓣化的主要环境因子，极易造成花朵畸形，严重影响其观赏和使用价值。因此，研究低温导致切花月季花瓣过度重瓣化的分子机制具有重要的理论和实践意义。AGAMOUS(AG)作为唯一具有C功能的基因，在植物的花发育中起到至关重要的作用。我们通过生物信息学分析和RACE PCR技术克隆得到切花月季AG基因全长，命名为RhAG;并进一步对RhAG的基本特性、生物学功能及在低温条件下的转录水平进行了分析，其结果如下:
　　1.随着温度的降低，在一定温度范围内，切花月季的花瓣数量增加，雄蕊数量减少，形成畸形花的比例升高;并且，在内层花瓣中有源自于雄蕊的迹象。
　　2.通过观察不同温度条件下切花月季的花芽分化进程，结果显示切花月季花芽分化进程划分为萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期和分化完成期五个时期;并且，低温导致的花瓣过度重瓣化发生在雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。
　　3.RhAG基因属于MADS-box基因，具有高度保守的MADS-box区域和K-box区域。通过同源性比对结果表明RhAG基因属于切花月季的C功能基因，并且与模式植物的AG基因具有较高的同源性。
　　4.RhAG-GFP瞬时转化洋葱表皮细胞，证明RhAG定位在细胞核内。
　　5.RhAG的转录水平受温度的影响，通过比较常温和低温条件下RhAG基因的表达量，结果表明低温导致RhAG基因在花发育第3、4轮的表达量降低。
　　6.RNA原位杂交实验结果显示，在第3、4轮花器官发育时检测到RhAG的转录物，并且低温导致RhAG基因的表达区域向中间收缩。
　　7.根据RhAG基因的测序结果及对载体结构的分析，设计一对特异引物，并在两端引入合适的酶切位点，以pTRV2为基础构建了病毒诱导的基因沉默载体pTRV2-RhAG，为后期研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩写词目录

1 引言

1．1 研究背景

1．2 观赏植物重瓣花的研究进展

1．2．1 重瓣花的起源方式

1．2．2 重瓣花形成的分子机制

1．2．3 影响重瓣花形成的因素

1．3 AGAMOUS基因研究进展

1．3．1 拟南芥AGAMOUS基因

1．3．2 拟南芥AGAMOUS基因与其他花器官发育基因的互作关系

1．3．3 其他物种AGAMOUS基因研究进展

1．4 RNA原位杂交技术简介

1．5 研究目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株及载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 常用溶液及培养基的配置

2．2 试验方法

2．2．1 植物材料培养

2．2．2 月季开花观察及花器官数量统计

2．2．3 石蜡切片制法

2．2．4 目的基因的克隆

2．2．5 RACE克隆月季AGAMOUS基因全长cDNA

2．2．6 洋葱表皮亚细胞定位

2．2．7 目的基因转录表达水平检测

2．2．8 RNA原位杂交

2．2．9 病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建

3 结果与分析

3．1 不同温度条件处理下切花月季花朵形态学观察

3．1．1 不同温度条件处理下切花月季形成畸形花的比例

3．1．2 不同温度条件处理下切花月季花器官数量统计

3．2 常温和低温条件下切花月季‘芬得拉’花器官发育进程比较观察

3．2．1 萼片原基分化期

3．2．2 花瓣原基分化期

3．2．3 雄蕊原基分化期

3．2．4 雌蕊原基分化期

3．2．5 分化完成期

3．3 月季AGAMOUS基因(RhAG)全长克隆及序列分析

3．3．1 从月季中分离RhAG基因

3．3．2 RhAG序列分析

3．5 RhAG定位在细胞核内

3．5．1 亚细胞定位载体构建

3．5．2 亚细胞定位

3．6 不同温度条件下RhAG基因在花器官发育各时期的表达量变化

3．6．1 半定量RT-PCR检测RhAG基因表达量

3．6．2 实时荧光定量PCR分析RhAG基因表达量

3．7 RhAG在切花月季上的表达模式及不同温度条件下的差异

3．8 月季中沉默RhAG基因载体构建

4 讨论

4．1 低温与切花月季花瓣过度重瓣化的关系

4．2 切花月季AGAMOUS基因的结构及序列分析

4．3 低温引起的切花月季花瓣过度重瓣化与RhAG基因的关系

4．4 病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)沉默RhAG基因的载体构建

5 结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢

低温诱导切花月季过度重瓣化的形态学观察