枣树田间愈伤组织诱导及芽再生体系的应用

摘要

枣树（Ziziphus jujuba Mill.）已经发展成为我国第一大干果树种，快速发展的枣产业，迫切需要换代型品种。但枣树杂交育种难度大，芽变选种费时费力，因此人们开始尝试其它的育种方法，如多倍体育种等。本课题组前期在田间愈伤组织诱导及芽再生技术体系基础上，建立了免嵌合体纯化的多倍体诱导技术并创制了20余个枣品种和酸枣类型的纯合多倍体种质。本研究拟开展田间愈伤组织诱导和芽再生技术体系在原位遗传转化、EMS诱变等中的应用研究，以期为免嵌合体纯化的转基因育种、诱变育种等奠定基础。主要研究结果如下:
　　1.枝条粗度对芽再生有一定的影响。分别对粗度1.0-2.5cm的枝条进行了愈伤组织诱导和芽再生研究，随着枝条的增粗，出芽数随之增多，2.0-2.5cm的枝条出芽数显著增高，但考虑到较粗枝条的数量较少且对树体伤害较大，因此认为适宜的枝条粗度为1.5-2.0cm，对树体伤害小，芽再生能力强。
　　2.发根农杆菌的侵染时期影响‘大荔龙枣’枝条截面愈伤组织诱导和芽再生能力。分别在截枝后的第1d、4d、7d、10d进行侵染，侵染后，愈伤组织的生长短暂受抑，第20d后各处理间的愈伤组织生长量差异不大;在截枝后7d之内进行侵染，芽再生能力强，但没有获得转化芽。
　　3.根癌农杆菌菌液浓度影响‘月光枣’枝条截面愈伤组织诱导、芽再生能力及转化效率。菌液浓度(OD600)在0.4-1.2范围内对枝条截面愈伤组织量没有显著影响;截枝后20d，菌液浓度为0.8的处理出芽数最多，但30d时各处理出芽数与对照之间均无显著差异，说明菌液可在前期影响愈伤组织出芽，但并不会影响最终的出芽数。本研究在菌液浓度为0.4时获得了2个转化芽，观察发现，转化芽生长矮小，长势较弱，这可能是由于农杆菌的侵染影响了枝条的生长发育。
　　4.根癌农杆菌侵染时间对‘月光枣’枝条截面愈伤组织诱导、芽再生能力的影响不显著。侵染时间分别为12h、24h、36h和48h时，愈伤等级及出芽数均无显著差异。
　　5.根癌农杆菌的侵染次数影响‘月光枣’枝条截面愈伤组织诱导、芽再生能力及转化效率。愈伤组织诱导后第10d，侵染3次较侵染2次或1次的愈伤组织等级低，并且也低于对照;愈伤组织诱导后第20d，不同侵染次数愈伤组织等级差异不明显，但有随着侵染次数的增多而降低的趋势。愈伤组织诱导后第20d，出芽数随着侵染次数的增多而降低，侵染1次的出芽数与对照差异不显著，但却显著高于侵染2次或3次的出芽数。愈伤组织诱导后第30d，不同侵染次数的出芽数差异均不显著。本试验也未获得转化芽，因此从利于出芽及省时方面考虑，侵染1次为宜。
　　6.利用田间愈伤组织诱导和芽再生技术对4个优良鲜食枣品种（‘无核丰’、‘京枣39’、‘冷白玉’、‘六月鲜’）进行了秋水仙素诱变。获得了‘京枣39’的三倍体和二、四嵌合体。
　　7.利用田间愈伤组织诱导和芽再生技术对‘月光枣’进行了不同浓度(0.1％、0.3％、0.5％、0.7％和1.0％)的EMS诱变，结果发现，磷酸缓冲液(PBS)和EMS都会对愈伤组织和出芽产生伤害，再生芽的变异情况需进行进一步观察。

目录

声明

摘要

缩略词目录

1 引言

1．1 本研究的目的和意义

1．2 前人研究进展

1．2．1 植物遗传转化技术

1．2．2 果树基因工程研究进展

1．2．3 EMS及其在植物中的应用

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 农杆菌菌株及载体

2．1．3 诱变试剂

2．2 试验条件

2．2．1 试验主要试剂

2．2．2 试验主要仪器

2．2．3 试剂配制

2．2．4 主要培养基配方

2．3 试验方法

2．3．1 枣树的原位遗传转化

2．3．2 田间愈伤组织途径进行枣树纯多倍体的诱导

2．3．3 田间愈伤组织途径进行枣树的EMS诱变

2．3．4 再生芽的越冬保护

2．3．5 试验结果统计分析

3 结果与分析

3．1 枝条粗度对‘月光枣’截面愈伤组织出芽情况的影响

3．2 影响农杆菌遗传转化效果的因素

3．2．1 农杆菌侵染时期对截面愈伤组织、出芽数及转化芽数的影响

3．2．2 菌液浓度对愈伤组织、出芽数及转化芽数的影响

3．2．3 侵染时间对愈伤组织、出芽数及转化芽数的影响

3．2．4 侵染次数对‘月光枣’枝条愈伤组织、出芽数及转化芽数的影响

3．3 转化材料的PCR检测

3．3．1 发根农杆菌转化‘大荔龙枣’所得材料的PCR检测

3．3．2 根癌农杆菌转化‘月光枣’所得材料的PCR检测

3．4 田间愈伤组织诱导及芽再生技术在枣树多倍体诱导中的应用

3．4．1 不同枣树品种的田间愈伤组织生长及芽再生情况

3．4．2 ‘京枣39’的秋水仙素诱变效果

3．5 田间愈伤组织诱导及芽再生体系进行枣树的EMS诱变

3．5．1 不同浓度EMS溶液对‘月光枣’枝条截面愈伤组织及出芽数的影响

3．5．2 不同浓度EMS溶液处理的枝条截面死亡情况

3．6 转化材料的越冬保护

4 讨论

4．1 枣树田间愈伤组织诱导及芽再生技术的优势

4．2 影响枣树田间愈伤组织及芽再生的因素

4．3 影响本研究枣树原位遗传转化效率的因素

4．3．1 菌液浓度对本试验遗传转化效率的影响

4．3．2 其他因素对本试验遗传转化效率的影响

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢