鸡传染性支气管炎病毒XT株的分离鉴定及S1基因、M基因的序列分析

摘要

本研究从北京某集团公司邢台地区的肉鸡场，采集疑似鸡传染性支气管炎的发病鸡病料，从中分离得到一株病毒，命名为XT株，并对其理化及生物学特性进行鉴定，最终通过基因的测序、对比，来分析它的遗传变异性。
　　无菌采集疑似患传染性支气管炎病鸡的气管、肾脏、腺胃等，研磨制成病毒液，在10日龄SPF鸡胚上传代，并收集尿囊液。尿囊液对鸡红细胞无直接血凝性，经1％胰酶处理后出现血凝现象;新城疫干扰试验显示XT株F5代尿囊液对新城疫Lasota株在鸡胚中的复制具有干扰作用，使其血凝效价下降了2～3个值;将XT株F5代尿囊液接种10日龄鸡胚144 h后，与对照组相比，试验组鸡胚发育迟缓，经SPSS V17分析两组鸡胚体重差异极显著，说明XT株对鸡胚具有致矮小作用;病毒回归试验动物后，鸡只出现了典型的IBV临床及解剖症状，且采集所有鸡只病料分离得到的病毒液，经IBV RT-PCR诊断试剂盒检测，对照组均为阴性，试验组绝大多数为阳性，说明试验鸡不同程度的感染了IBV。
　　XT株理化特性试验表明:该病毒对酸(pH3.0)碱(pH11.0)均敏感，并且病毒对酸的耐受力要比对碱的耐受力略强;经56℃，1h水浴加热，毒力下降了3个滴度，而添加Mg2+组毒力下降不到2个滴度，说明病毒对热敏感，Mg2+能提高其耐热性;病毒对有机溶剂乙醚、氯仿均敏感，处理后毒力均下降了2～3个滴度，以上特性均符合传染性支气管炎病毒的相关特性。经测定，XT株F5代病毒液的EID50为10-5.69/0.1ml;血清交叉中和试验结果显示:XT株与传支疫苗株H120、W93的关系系数分别为77.98％、44.88％，依据判定标准（R＞80％，两毒株为同一亚型;25％＜R＜80％，两毒株为同一血清型的不同亚型;R＜25％，两毒株为不同血清型），XT株与二者均为同一血清型的不同亚型。
　　本试验对XT株的S1基因、M基因进行了克隆测序，并与Genbank中已发表的18个参考株S1基因、M基因进行了比较分析，结果显示，XT株S1基因与国内常用疫苗株H120、H52、Ma5、M41、W93的同源性仅为76％～77％，而与山东分离株WF同源率较高，核苷酸同源率为91.3％，氨基酸同源率为90.9％，M基因序列对比结果与S1基因基本一致，但M基因与各参考毒株序列同源性总体较S1基因高，说明M基因较S1基因保守。序列对比结果显示:XT株与当前国内广泛使用的疫苗株同源性较低，与一株山东分离株WF同源性较高。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 鸡传染性支气管炎概述

1．2 IBV的病原学分类

1．3 IBV病毒的粒子结构

1．4 IBV基因组结构

1．5 IBV主要结构蛋白及功能

1．5．1 S蛋白

1．5．2 M蛋白

1．5．3 N蛋白

1．5．4 E蛋白

1．6 IBV的遗传变异

1．6．1 基因突变产生新毒株

1．6．2 基因重组产生新毒株

1．6．3 免疫压力引起的遗传变异

1．6．4 新毒株的引进

1．7 IB疫苗的研究进展

1．7．1 弱毒疫苗

1．7．2 灭活疫苗

1．7．3 基因工程疫苗

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 分离毒株

2．1．2 试验毒株与鸡胚

2．1．3 PCR及克隆所需试剂

2．1．4 仪器设备

2．1．5 主要试剂的配制

2．1．6 引物

2．1．7 参考毒株及Genbank登录号

2．2 试验方法

2．2．1 病毒的分离与鉴定

2．2．2 XT株理化特性的研究

2．2．3 XT株生物学特性的研究

2．2．4 PCR扩增

3 结果

3．1 鸡胚传代结果

3．2 血凝试验

3．3 新城疫干扰试验

3．4 致鸡胚矮小试验

3．5 动物回归试验

3．6 XT株理化特性的研究

3．6．1 pH敏感试验

3．6．2 热敏感试验及Mg2+保护试验

3．6．3 乙醚氯仿敏感试验

3．7 XT株生物学特性

3．7．1 EID50结果

3．7．2 交叉中和试验结果

3．8 XT株S1基因和M基因序列测定及分析

3．8．1 RT-PCR结果

3．8．2 重组质粒PCR鉴定结果

3．8．3 测序结果

3．8．4 序列分析

4 讨论

4．1 前期工作

4．2 病毒的分离与鉴定

4．3 血凝试验

4．4 新城疫干扰试验

4．5 致鸡胚矮小化试验

4．6 动物回归试验

4．7 病毒理化特性的研究

4．8 病毒的交叉中和试验

4．9 PCR试验的关键步骤

4．10 PCR产物的测序问题

4．11 序列对比

4．12 本试验的局限性

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及参编书籍

作者简历

致谢