山羊Agouti基因外显子1剪接体及启动子活性区研究

摘要

本试验以云南黑山羊的Agouti基因序列为模板设计引物，利用黑白两种颜色的山羊基因组作为样品对Agouti基因部分序列进行扩增，获得了Agouti基因的部分序列。
　　根据不同毛色山羊Agouti基因5'非翻译区外显子1剪接体不同类型，设计引物，采用黑白两种颜色的山羊个体进行剪接体验证。试验结果表明:所选山羊个体的剪接体类型均为ItIt'。
　　山羊基因组序列（登录号:AJPT01136617.1）中有两段序列与牛的预测启动子同源性比较高，因此设计引物扩增目的片段A和B，同时构建两个荧光素酶报告基因质粒PGL3-basic-A和PGL3-basic-B。并用构建的荧光素酶报告基因质粒瞬时转染人皮肤黑素瘤细胞A375（皮肤细胞）和293T细胞（非皮肤细胞）来检测两段目的片段是否具有Agouti基因启动子活性。结果用SPSS19.0软件进行分析，结果表明:所构建的目的片段的质粒与阴性对照相比不存在显著性差异，说明所获得的两段目的片段均不具有启动子活性。

目录

声明

论文说明

摘要

1．引言

1．1 毛色遗传的研究现状

1．2 Agouti基因的研究

1．3 本课题组对山羊Agouti基因研究成果

1．4 本研究的目的意义及主要内容

2．材料与方法

2．1 试验材料及设备

2．1．1 试验样品及来源

2．1．2 常规试剂来源及配制

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要分析软件

2．2 试验方法和步骤

2．2．1 DNA的提取及纯度和浓度的检测

2．2．2 山羊皮肤组织RNA提取、纯化、检测和反转录

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 PCR产物纯化与胶回收

2．2．5 目的片段的克隆及阳性克隆的鉴定

2．2．6 小量提取质粒与酶切鉴定

2．2．7 双酶切及重组质粒pGL3-Basic-A和pGL3-Basic-B的构建

2．2．8 无内毒素大提质粒和浓度测定

2．2．9 细胞培养及转染

2．2．10 Luc报告基因活性检测及数据处理

3．结果与分析

3．1 山羊基因组DNA的提取结果

3．2 山羊皮肤组织RNA的提取结果

3．3 Agouti基因部分序列PCR扩增及序列比对结果

3．4 Agouti基因外显子1剪接体验证PCR扩增与序列比对结果

3．5 目的片段A和B的启动子区活性验证

3．5．1 目的片段的序列比对结果

3．5．2 promoterA和promoterB的PCR扩增

3．5．3 重组质粒PMD19-T-A，和PMD19-T-B的PCR鉴定与双酶切鉴定

3．5．4 重组质粒PGL3-basic-A和PGL3-basic-B的PCR鉴定与双酶切鉴定

3．5．5 测序鉴定

3．5．6 promoterA和promoterB启动子活性的鉴定

4 讨论

4．1 提取基因组DNA

4．2 RNA的提取

4．3 PCR扩增

4．4 细胞培养

4．5 关于山羊剪接体的讨论

4．6 关于山羊启动子的讨论

5 结论

参考文献

在读期间发表论文情况

作者简历

致谢