库姆塔格沙漠微生物物种多样性及建兰炭疽病菌拮抗菌株的筛选

摘要

本沦文通过可培养方法从库姆塔格沙漠土壤样品获得菌株，依据平板上菌落形态的不同进行菌株的分离纯化及16S rDNA序列测定，并对菌株进行种属鉴定及种群多样性分析。然后从分离保存的菌株中，通过平板对峙法和平板扩散法筛选得到一株对建兰炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）具有较高拮抗活性的菌株N147-1-3，并对菌株进行16SrDNA序列分析和生理生化试验鉴定，最后对抑菌物质进行初步探索，并对性质做了分析。研究结果如下:
　　利用两种培养基(R2A、1/4R2A)对从库姆塔格沙漠的9份土壤样品进行分离菌株，共得到190株菌株。菌株主要分布在在厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，经统计该沙漠区域内分离的菌株共有30个属，57种，其中芽孢杆菌有119株，占总菌株数的63％，为该沙漠区域的优势种。潜在的新种有22株，经与EzBioCloud网站数据已知序列的相似性相比在97.5％以下，占总菌株的11％，有待进一步研究。对R2A培养基和1/4R2A培养基分离的菌株的种群多样性的四个参数为:R2A:物种丰富度(S)为12.37±56.55、优势度指数(D)为0.2913±0.0536、Shannon-Wiener(H)为1.3262±0.3612、均匀度指数(E)为0.6034±0.0312。1/4R2A:物种丰富度(S)为10.62±41.41、优势度指数(D)为0.3566±0.0544、Shannon-Wiener(H)为1.3025±0.3576、均匀度指数(E)为0.6066±0.0476。
　　从分离保存的菌株中筛选得到一株对建兰炭疽病菌有较高活性的菌株N147-1-3，经16S rDNA序列分析和生理生化试验结果，将菌株鉴定为甲基营养性芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。菌株抑菌物质的摇瓶发酵条件优化结果为:5.0％蔗糖，2.0％NaNO3，0.05％CaCl2和0.3％KNO3，pH7.0，发酵时间为48 h，接种量为5.0％，装液量为250 mL三角瓶装有125 mL培养液。拮抗菌株的粗蛋白经60％的硫酸铵沉淀后具有最高的抑菌活性，经氯仿抽提后不具有拮抗活性;经高温处理和蛋白酶K作用后，抑菌物质的拮抗作用消失，初步分析该抑菌物质是蛋白类物质。抑菌物质对温度比较敏感，随着温度的升高，活性逐渐降低;在pH6.0时活性达到最大值;对金属离子的依赖性不强。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 库姆塔格沙漠简介

1．1．1 库姆塔格沙漠的地理情况

1．1．2 库姆塔格沙漠土壤情况

1．1．3 库姆塔格沙漠的植被动物情况

1．2 极端微生物的研究情况

1．2．1 极端微生物与极端环境的定义

1．2．2 嗜热微生物及其应用

1．2．3 嗜冷微生物及其应用

1．2．4 嗜酸微生物及其应用

1．2．5 嗜碱微生物及其应用

1．2．6 嗜盐微生物及其应用

1．2．7 嗜压微生物及其应用

1．3 土壤微生物多样性的研究方法

1．3．1 土壤微生物研究进展

1．3．2 土壤微生物的可培养方法

1．4 国内建兰炭疽病的研究进展

1．4．1 建兰简介

1．4．2 建兰炭疽病病原菌

1．4．3 建兰炭疽病的防治方法

1．5 防治建兰炭疽病的前景

1．6 本论文研究日的、意义以及主要内容

1．6．1 本论文研究的目的意义

1．6．2 本论文研究的内容

第二章 库姆塔格沙漠微生物物种多样性

2．1 试验材料

2．1．1 样品采集

2．1．2 试验仪器

2．1．3 供试培养基

2．1．4 供试试剂

2．2 试验方法

2．2．1 样品的稀释涂布

2．2．2 菌株总数计算

2．2．3 菌株的纯化与保藏

2．2．4 菌株DNA的提取

2．2．5 PCR技术扩增菌株DNA

2．2．6 测序与序列比对

2．3 实验结果

2．3．1 土壤样品的微生物生物量的结果

2．3．2 菌株的分离与保存

2．3．3 菌株16S rDNA序列比对结果

2．4 种群发育树的构建与种群多样性分析

2．5 讨论

第三章 建兰炭疽病菌拮抗菌株的筛选

3．1 试验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 培养基与试剂

3．1．3 实验仪器

3．2 试验方法

3．2．1 病原菌平板的制作

3．2．2 初筛

3．2．3 复筛

3．2．4 形态学鉴定

3．2．5 16S rDNA序列分析

3．2．6 生理生化鉴定

3．2．7 拮抗菌株的抑菌谱测定

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株的初筛结果

3．3．2 菌株的复筛结果

3．3．3 形态观察结果

3．3．4 16S rDNA序列分析结果

3．3．5 生理生化鉴定结果

3．3．6 拮抗菌株的抑菌谱测定结果

3．4 讨论

第四章 拮抗菌株的发酵条件优化

4．1 试验材料

4．1．1 供试菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 试验仪器

4．2 试验方法

4．2．1 种子培养

4．2．2 发酵培养

4．2．3 正交试验

4．2．4 抑菌面积的测定

4．3 试验结果

4．3．1 不同碳源对菌株抑菌活性的影响

4．3．2 不同氮源对菌株抑菌活性的影响

4．3．3 不同无机盐对菌株抑菌活性的影响

4．3．4 培养基组成正交试验结果

4．3．5 培养条件正交试验

4．4 讨论

第五章 拮抗菌株抑菌物质的初步确定

5．1 试验材料

5．1．1 供试菌株

5．1．2 供试培养基与试剂

5．1．3 试验仪器

5．2 试验方法

5．2．1 菌种活化

5．2．2 发酵培养

5．2．3 抑菌物质分离与活性检测

5．2．4 氯仿处理结果

5．2．5 高温处理结果

5．2．6 蛋白酶K处理结果

5．3 试验结果

5．3．1 硫酸铵逐级沉淀结果

5．3．2 氯仿抽提结果

5．3．3 高温处理结果

5．3．4 蛋白酶处理结果

5．4 讨论

第六章 拮抗菌抑菌物质性质研究

6．1 试验材料

6．1．1 供试菌株

6．1．2 供试培养基与试剂

6．1．3 试验仪器

6．2 试验方法

6．2．1 抑菌粗蛋白的制备

6．2．2 最适耐热温度的确定

6．2．3 最适pH的确定

6．2．4 金属离子对抑菌物质的影响

6．3 试验结果

6．3．1 最适耐热温度的确定结果

6．3．2 最适pH的确定的结果

6．3．3 金属离子对抑菌物质的影响的结果

6．4 讨论

结论

参考文献

在读期间已发表论文

个人简历

致谢