玉米鞘腐病拮抗菌的分离鉴定、菌剂制备及拮抗基因的克隆

摘要

玉米是我国第一大粮食作物，病害一直是影响玉米产量和品质的重要因素之一。玉米鞘腐病作为玉米新病害近年来呈现加重和扩散趋势，而目前对其病菌致病机理和病害发生规律研究起步较晚，生产上也缺乏较有效的防治手段。由于化学农药的长期不合理且过量使用，产生了诸如水源和土壤污染、农药残留、病菌抗药性等问题。本研究拟从土壤中分离筛选拮抗玉米鞘腐病的主要生防菌，摸索其廉价高效的菌剂剂型，初步探究生防菌的拮抗机理，期望克隆得到调控拮抗物质分泌的相关基因，为玉米鞘腐病的生物防治奠定理论基础，为生防菌的遗传改良及其合理利用提供科学依据和遗传材料。
　　1.从黄瓜根际土壤中成功获得了1株对玉米鞘腐病有拮抗活性的优良菌株C16。经形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillusubtilis）。研究发现，C16菌株传代数次后仍具有较强的抑菌活性，且抗菌谱较广，其代谢产物对层出镰孢（Fusarium proliferatum）、禾谷镰孢（F.graminearum）和拟轮生镰孢(F.verticillioides)拮抗活性强，为玉米鞘腐病的防治提供了新的菌种资源。此外，C16菌株对腐霉菌（Pythium aphanidermatum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）以及核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）等也均表现出了较强的拮抗活性。
　　2.研制出玉米鞘腐病拮抗菌株C16的粗面粉-硅藻土活体颗粒剂，并利用琼脂扩散-抑菌圈法测定了颗粒剂对层出镰孢的拮抗活性，测定了不同贮存温度对颗粒剂中活菌数量及对玉米层出镰孢拮抗活性的影响。结果显示，颗粒剂中最适载体为硅藻土，其与C16的种子液最适比为1∶2(m∶v)，最适粘合剂和营养添加剂为粗面粉。颗粒剂中活菌数量和对玉米层出镰孢的拮抗活性均呈现“先增后减”的趋势，贮存7d时活菌数和抑菌圈直径达最大值，分别为9.6×109cfu/mL和4.9cm;此后逐渐降低。各贮存温度相比较，25℃下的C16颗粒剂中的活菌数和拮抗活性均最高，90d时活菌数为7.3×108cfu/mL，抑菌圈直径为2.6cm。因此，选择25℃贮存C16菌株颗粒剂。
　　3.PCR成功验证了玉米鞘腐病拮抗菌株C16中含有编码srfAA、srfAB、srfAC、fenA、fenB、ituB的生物合成基因，证实了Surfactin、Fengycin和Iturin是芽孢杆菌属产生的脂肽类抗生素。通过比对，C16菌株的fenA基因与已报道产Plipastatin而不产Fengycin的B.subtilis168菌株差异显著，但与产Fengycin并对丝状真菌有较强拮抗活性的SG6菌株相似度高。通过对片段进行线性化然后利用重叠PCR的方法，成功克隆得到了fenA基因全长，为11kb。

目录

声明

摘要

缩写词表

1 引言

1．1 玉米鞘腐病的发生与危害

1．2 玉米鞘腐病病原菌及其致病机制

1．3 玉米鞘腐病防治现状

1．3．1 轮作调茬

1．3．2 抗病品种

1．3．3 及时防控

1．3．4 严控虫害

1．3．5 化学防治

1．4 生物菌剂在植物病害防治方面的应用

1．5 脂肽类物质及其抗真菌作用

1．5．1 脂肽类物质

1．5．2 脂肽类物质的产生与抑菌作用

1．6 本研究的目的与意义

2 材料和方法

2．1 菌株和植物材料

2．2 培养基

2．3 试剂与溶液配置

2．3．1 主要试剂

2．3．2 溶液的配制

2．4 仪器与设备

2．5 玉米鞘腐病拮抗菌株分离、筛选与鉴定试验

2．5．1 菌株分离

2．5．2 菌株筛选

2．5．3 抗菌谱

2．5．4 胞外分泌物的抑菌活性

2．5．5 抑菌试验

2．5．6 菌株形态观察及生理生化特性测定

2．5．7 菌株的16S rDNA的鉴定

2．6 C16菌株颗粒剂的制备及活性测定

2．6．1 菌悬液的制备

2．6．2 载体的筛选

2．6．3 粘合剂(营养添加剂)的筛选

2．6．4 C16菌株颗粒剂的制备

2．6．5 不同贮存温度对C16菌株颗粒剂的拮抗活性和活菌数的影啊

2．7 C16菌株拮抗基因的克隆

2．7．1 C16菌株基因组DNA的提取

2．7．2 C16菌株基因组DNA文库的建立

2．7．3 C16菌株中生防相关基因的扩增

2．7．4 C16菌株中生防相关基因的同源比对

2．7．5 C16菌株fenA全基因的克隆

2．7．6 C16菌株fenA基因表达载体的构建

3 结果与分析

3．1 对玉米鞘腐病拮抗细菌的分离、筛选与鉴定

3．1．1 玉米鞘腐病拮抗菌株的筛选

3．1．2 C16菌株的抗菌谱

3．1．3 C16菌株胞外粗提物的抑菌活性

3．1．4 C16菌株对病原真菌分生孢子生长的影响

3．1．5 C16菌株的外观形态及生理生化特性

3．1．6 C16菌株的16S rDNA分子鉴定

3．2 C16菌株颗粒剂的制备及其活性测定

3．2．1 载体的筛选

3．2．2 粘合剂(营养添加剂)的筛选

3．2．3 不同贮存温度下C16菌株颗粒剂的拮抗活性

3．2．4 贮存温度对C16菌株颗粒剂的活菌数量影响

3．3 C16菌株拮抗基因的克隆

3．3．1 C16菌株基因组DNA提取

3．3．2 C16菌株基因组DNA文库的建立

3．3．3 C16菌株中生防相关基因的扩增

3．3．4 C16菌株中生防相关基因的同源比对

3．3．5 C16菌株fenA全基因的克隆

4 讨论

4．1 玉米鞘腐病主要致病原拮抗菌的筛选

4．2 利用活体制剂防治玉米鞘腐病

4．3 玉米鞘腐病拮抗菌C16的拮抗基因克隆

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢