榆树叶片虫瘿形成过程中生理应答反应及转录组学和蛋白质组学研究

摘要

榆瘿蚜（Tetran euraakinire Sasaki）是危害榆树最严重的害虫之一，可导致叶片形成大量虫瘿，严重影响榆树的正常生长发育。目前，有关榆树对榆瘿蚜侵袭的反应以及虫瘿形成的分子机理尚不清楚。本研究应用生化分析方法，测定分析了榆瘿蚜取食后榆树叶片中信号分子含量的变化及相关抗性酶活性的变化，探讨了寄主植物在虫瘿形成过程中的生理应答和信号传导路径;运用转录组学和蛋白组学分析方法，从差异表达基因和差异蛋白质层面探讨了榆瘿蚜取食榆树叶片胁迫下叶片的响应情况，为进一步研究榆树虫瘿形成的分子机制以及探讨植物和昆虫之间的分子关系提供研究基础。主要研究结果如下:
　　(1)研究分析了榆瘿蚜危害榆树叶片形成虫瘿的三个主要生理过程中信号分子的变化和相关酶活性的变化，结果显示:茉莉酸(jasmonic acid，JA)含量和脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、丙二烯氧化物合成酶(allene oxidesynthase，AOS)及多酚氧化酶(polyphenod oxidase，PPO)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性均明显升高，表明榆瘿蚜取食诱导了叶片体内JA含量的增加;相关抗性酶SOD、PPO、POD、过氧化氢酶(catalase，CAT)参与了抵御榆瘿蚜危害虫瘿形成过程的反应。
　　(2)转录组分析共获得102017个Unigenes，在NR数据库中有75％可以比对，经功能注释，发现大量与细胞增殖、初生和次生物代谢、逆境响应、氧化胁迫、生物调节、蛋白磷酸化、蛋白转录翻译修饰、信号转导等相关的功能基因;经BLAST软件分析，Pathway中发现有12640个(37.4％)基因被成功映射到110代谢通路上，涉及糖酵解、三羧酸循环、苯丙氨酸生物合成、次生代谢、植物激素信号转导、植物-病原物互作等代谢通路，其中，5.78％涉及植物与病原物互作，4.2％涉及三羧酸循环，2.15％涉及植物激素信号转导;有35398个Unigenes没有比对成功，它们可能是新的转录本，或者是由于榆树无标准的基因组区别于其它物种而特有的基因。
　　(3)榆瘿蚜危害榆树叶片形成虫瘿不同发育时期基因表达显著不同，经基因过滤，并采用DEseq进行差异基因的极显著筛选（筛选标准为2倍差异，同时FDR小于等于0.01），得到的差异极显著基因共计562个，并对差异基因进一步分析，其中以未侵染的叶片T1和侵染T2期相比，有244个差异表达基因，其中192个上调52个下调，以T1和侵染T3期相比差异表达基因有175个，其中上调145个下调30个，T1期和T4期相比差异表达基因共372个，其中上调360个下调12个;经Venn分析三者组共同的差异基因为34个，并经RT-PCR进行了实时荧光定量验证。34个基因的差异变化在三个侵染时期与对照T1的差异比较中都一致，即28个均上调，6个均下调，其中比较重要起特殊作用的有脂氧合酶、谷胱甘肽-S-转移酶、6-磷酸果糖激酶、微管蛋白、纤维素合成酶、蛋白酶抑制剂等，其中，在T2期，主要上调基因有微管蛋白、6-磷酸果糖激酶等相关细胞增殖和呼吸作用的基因;在T3期上调的有脂氧合酶、谷胱甘肽-S-转移酶、超氧化物歧化酶和蛋白酶抑制剂等相关基因进行防御;在T4期上调基因主要有纤维素合成酶等相关基因。
　　(4)显著性富集Pathway分析表明，榆瘿蚜危害叶片后，在T2和T3富集通路分别有31条和30条，其中大部分通路与植物的抗逆性相关。叶片呼吸代谢途径的相关基因上调表达，包括三羧酸循环、戊糖磷酸途径以及糖酵解，这暗示了通过加强呼吸来抵御病原菌的侵染;启动多条抗性信号通路，包括SA途径、JA/ET途径等信号途径，在榆瘿蚜危害过程中，JA信号途径起主要作用;在榆瘿蚜危害下，叶片中多个抗氧化相关基因表达发生变化，通过变化来调整活性氧清除剂的表达水平以维持体内活性氧的平衡。而在生物学过程中表现为negative regulation of biological process的特性，表明此类差异基因在表达过程中起到一些负调控的作用。
　　(5)运用iTRAQ技术，通过对鉴定到所有榆瘿蚜取食诱导榆树叶片形成虫瘿过程中的蛋白与KEEG数据库进行比对，发现有2145个蛋白被注释到，65个未知功能的蛋白，推测为未发现的新蛋白。榆瘿蚜取食叶片形成虫瘿的不同发育阶段，差异蛋白不同，其中未被取食的叶片和初始形成期(T1-VS-T2)相比，差异蛋白有418个;未被取食的叶片和成长分化期(T1-VS-T3)相比，差异蛋白有321个;未被取食的叶片和开裂期(T1-VS-T4)相比，差异蛋白有390个。试验共筛选出虫瘿发育的不同时期T1-VS-T2、T1-VS-T3、T1-VS-T4三个时期共有的差异蛋白29个，这些蛋白涉及应激防御反应、细胞增殖、氧化还原过程、免疫系统过程和光合作用等生理过程。其中在榆瘿蚜取食形成虫瘿的初始形成和成长分化期持续发作用的有SOD、CAT和内切Chitinase等氧化还原酶类;在初始形成期还有持续发挥作用的翻译控制肿瘤蛋白TCTP和Actin;在榆瘿蚜取食形成虫瘿的开裂期起到重要抗性作用的有溶质的Cytosolic ascorbate peroxidase、Heat shock70 kDa protein和Cellulose synthase等。
　　由研究结果可以得出如下初步结论:榆树叶片虫瘿形成过程中，激活了体内JA信号转导途径，多种抗性酶活性增高;大量涉及代谢、蛋白质和纤维素合成、生长与防御等的相关基因上调表达;榆瘿蚜为害可诱导启动SA、JA/ET多条抗性信号通路，使得大量涉及应激防御反应、细胞增殖、氧化还原过程、免疫系统过程等的蛋白质差异表达。可以认为，榆树的这些生理响应以及蛋白质和基因表达变化，构成了对虫瘿形成适应的生理和分子基础，提高了榆树对榆瘿蚜侵染的抵抗能力。

目录

声明

摘要

缩略词

1 引言

1．1 选题依据与研究意义

1．2 植物与昆虫相互关系研究进展

1．2．1 概述

1．2．2 虫瘿的研究现状

1．2．3 植物的应答反应研究现状

1．2．4 转录组学和蛋白组学

1．3 主要研究内容及技术路线

1．3．1 主要研究内容

1．3．2 技术路线

2 榆树叶片虫瘿形成过程中茉莉酸含量及相关防御酶活性的变化

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料与取样方法

2．1．2 试验试剂与仪器

2．1．3 试验方法

2．1．4 试验结果统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 虫瘿形成不同时期榆树叶片茉莉酸和水杨酸含量的变化

2．2．2 虫瘿形成不同时期榆树叶片相关防御酶活性的变化

2．3 讨论

2．3．1 榆树叶片形成虫瘿过程中信号分子含量的变化

2．3．2 榆树叶片形成虫瘿过程中叶片适应性酶系的变化

2．3．3 榆树叶片形成虫瘿过程中的适应性生理响应

2．4 小结

3 虫瘿形成过程中寄主榆树叶片组织的转录组学分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料与取样方法

3．1．2 试验试剂与仪器

3．1．3 试验方法

3．1．4 转录组测序流程

3．1．5 转录组生物信息学分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 RNA提取及质量检测分析

3．2．2 测序产出统计

3．2．3 组装结果统计

3．2．4 榆树叶片转录组Unigene功能注释

3．2．5 榆树叶片转录组Unigene COG功能分类

3．2．6 榆树叶片转录组Unigene GO功能分类

3．2．7 榆树叶片转录组Unigene代谢通路分析

3．3 讨论

3．3．1 转录组测序中获得的Unigenes

3．3．2 转录组测序中GO功能注释

3．3．3 转录组测序中KEGG pathway代谢通路

3．4 小结

4 虫瘿形成过程中寄主叶片组织差异表达基因分析

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料与取样方法

4．1．2 主要仪器和试验药品

4．1．3 试验方法

4．1．4 PCR荧光定量验证基因表达水平

4．2 结果与分析

4．2．1 基因评估测定

4．2．2 差异表达基因的筛选

4．2．3 差异基因聚类分析

4．2．4 GO的差异表达基因功能分析

4．2．5 基因差异表达Pathway分析

4．2．6 差异表达基因的鉴定

4．3 讨论

4．3．1 光合作用相关代谢途径及基因分析

4．3．2 呼吸作用相关代谢途径及基因分析

4．3．3 细胞命运相关代谢途径及基因分析

4．3．4 抗性相关代谢途径及基因分析

4．4 小结

5 虫瘿形成过程中寄主榆树叶片组织的蛋白质组学分析

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料与取样方法

5．1．2 试验试剂与仪器

5．1．3 试验方法

5．1．4 生物信息学分析

5．2 结果与分析

5．2．1 蛋白质检测

5．2．2 蛋白质鉴定质量评估

5．2．3 蛋白质GO功能注释

5．2．4 蛋白质COG功能分类

5．2．5 蛋白质Pathway分析

5．2．6 差异蛋白质信息统计分析

5．2．7 差异蛋白GO富集分析

5．2．8 差异蛋白的KEGG代谢途径富集分析

5．3 讨论

5．3．1 榆瘿蚜取食诱导榆树叶片形成虫瘿的蛋白质变化分析

5．3．2 榆瘿蚜取食诱导后榆树叶片的胁迫应答蛋白分析

5．4 小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢