布鲁氏菌主要外膜蛋白的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

摘要

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌（Brucella）侵入机体后引起的人畜共患慢性细菌性疾病，近年来，布鲁氏菌病已严重阻碍农牧区的经济发展，对人类健康造成严重的威胁。布鲁氏菌外膜蛋白(Omp)一直被视为布鲁氏菌研究的热点，刺激机体后可产生IgG抗体，且诱导机体产生强烈的免疫反应。布鲁氏菌诊断方法的建立大都基于LPS抗原，本试验试图建立一种基于外膜蛋白作为诊断抗原，用于高通量、快速检测布鲁氏菌抗体的间接ELSIA方法。
　　本文以布鲁氏菌外膜蛋白BP26、OMP31和OMP25为研究对象，PCR方法从布鲁氏菌S2疫苗株中扩增获得目的片段，成功构建原核表达质粒pET-28a-BP26、pGEX-6p-1-OMP31、pGEX-6p-1-OMP25，转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析表明，重组蛋白均成功表达，BP26、OMP31、OMP25蛋白分子质量分别为33kDa、52kDa、49kDa，与预期大小一致。通过镍柱亲和层析法纯化His融合蛋白pET-28a-BP26，通过KCl染色切胶纯化法纯化GST融合蛋白pGEX-6p-1-OMP31和pGEX-6p-1-OMP25。最后经Western blot分析表明3种重组蛋白均能与羊布鲁氏菌病阳性血清发生特异性反应。
　　将纯化的重组蛋白BP26、OMP31和OMP25分别以2ug/mL、3.5ug/mL、3ug/mL包被酶标板，对40份田间野毒感染羊血清样本进行检测，并用SVANOVA-ELISA试剂盒进行平行检测，将两种检测结果进行比较，结果显示，重组抗原BP26、OMP31和OMP25的敏感性分别为90.9％、86.9％、86.9％，特异性分别为83.3％、80％、76.9％。随后，将三种重组蛋白间接ELISA分别检测由试管凝集试验(SAT)检测均为阳性的羊血清20份，阴性羊血清10份。结果显示，重组抗原BP26的P/N值明显大于其它两个重组抗原的P/N值，因此，将BP26确定为诊断用抗原。
　　以纯化的重组蛋白BP26作为包被抗原，通过优化反应条件，建立布鲁氏菌病抗体ELISA榆测方法。结果表明，通过反应条件优化确定抗原的最佳稀释度为1∶3200，血清最佳稀释度为1∶20，二抗的最佳工作浓度为1∶20000，通过批间、批内重复性试验，变异系数均小于10％，表明本检测方法具有较高的重复性。用该方法对100份临床样本进行检测，并与试管凝集试验(SAT)进行相符性验证，符合率为94％。为布鲁氏菌病临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 布鲁氏菌病病原学

1．2 布鲁氏菌病流行病学概述

1．2．1 世界布鲁氏菌病疫情

1．2．2 我国布鲁氏菌病疫情

1．3 布鲁氏菌病外膜蛋白的研究进展

1．3．1 第一组外膜蛋白

1．3．2 第二组外膜蛋白

1．3．3 第三组外膜蛋白

1．4 布鲁氏菌病诊断方法的研究进展

1．4．1 病原学诊断

1．4．2 免疫学诊断

1．5 布鲁氏菌病疫苗的研究进展

1．5．1 布鲁氏菌疫苗的应用现状

1．5．2 布鲁氏菌疫苗的研究现状

1．6 本文的研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株、细胞和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 试剂盒

2．1．4 仪器设备

2．2 方法

2．2．1 目的基因的克隆

2．2．2 重组克隆载体的构建

2．2．3 重组表达质粒的构建

2．2．4 重组蛋白的表达

2．2．5 重组蛋白的纯化

2．2．6 重组蛋白的Western blot鉴定

2．2．7 优势抗原表位的筛选

2．2．8 羊布鲁氏菌病iELISA检测方法的建立及评价

3 结果与分析

3．1 结果

3．1．1 BP26基因的实验结果

3．1．2 OMP31基因的实验结果

3．1．3 OMP25基因的实验结果

3．1．4 优势抗原表位的筛选结果

3．1．5 羊布鲁氏菌病iELISA检测方法的建立及评价结果

3．2 小结

4 讨论

4．1 布鲁氏菌主要外膜蛋白的克隆及原核表达

4．2 羊布鲁氏菌病iELISA检测方法的建立

5 结论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

作者简历

致谢