裙带菜多糖提取纯化、结构及体外活性的初步探究

摘要

裙带菜(Undaria pinnatifida)是一种生长在温带的海藻类植物，富含大量多糖类物质等营养成分，具有很高的经济价值和药理价值。虽然已有文献对裙带菜多糖的提取纯化、结构及活性进行了研究，但是在结构及活性的关系方面缺乏更深入的研究。因此，本研究基于多糖的常规提取工艺，并通过对除蛋白次数进行条件优化制备裙带菜粗多糖，并进行分离纯化;采用HPLC，HPGPC，FTIR，NMR，β-消除反应，I2-KI试验，刚果红试验对裙带菜多糖的结构特征进行了分析;通过超氧阴离子及羟基自由基清除试验、羟基自由基清除试验、有机自由基清除试验、对Fe2+络合作用的试验对裙带菜多糖的体外抗氧化活性进行分析;通过α—淀粉酶活性抑制试验、α—葡萄糖苷酶活性抑制试验、葡萄糖吸收能力的测定、胆汁酸阻滞指数的测定分析了裙带菜多糖各组分的体外降血糖活性。主要研究结果如下:
　　采用水提醇沉法提取裙带菜中的多糖组分，并对其除蛋白次数进行条件优化，得到最佳除蛋白次数为六次，再经透析、冻干后得到粗多糖PUP，得率为3.94％。采用DEAE阴离子交换琼脂糖凝胶柱对PUP进行分离纯化，得到了两个多糖组分，分别为PUP-1，PUP-2，得率分别为2.76％，0.33％。通过丙烯葡聚糖凝胶G-150进一步验证两组分为均一性多糖。
　　通过对三种组分理化性质的分析可得，三种组分水溶性较好，且不溶于氯仿、丙酮、乙醚等有机试剂;外观有所差异，PUP为淡黄色絮状固体，PUP-1为白色絮状固体，PUP-2为淡黄色蓬松状固体;三种组分的苯酚硫酸反应均呈阳性，碘—碘化钾反应呈阴性，斐林试剂反应呈阴性，表明三种组分均为糖类化合物，不含淀粉及还原糖。纯化后多糖样品PUP-1、PUP-2的总糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量、硫酸根含量均比粗多糖PUP有所提高，PUP、PUP-1、PUP-2总糖含量分别为45.60％、64.08％和51.61％,蛋白含量分别为0.47％、2.26％、2.33％，糖醛酸含量分别为6.37％、12.25％、10.36％,硫酸根含量分别为15.42％、27.93％和28.77％。高效凝胶渗透色谱法对纯化后多糖分子量进行分析，其中PUP-1的分子量为51.9Da，PUP-2的分子量为62.5Da。
　　粗多糖及纯化后多糖主要单糖组成均为岩藻糖，但单糖种类及摩尔比略有差异。其中，PUP为Man∶Glu∶Gal∶Fuc=9.27∶9.85∶16.86∶22.61;PUP-1为Glu∶Gal∶Fuc=18.04∶12.47∶18.67;PUP-2为Man∶Glu∶Gal∶Fuc=16.83∶4.14∶22.24∶29.73;FTIR结果表明三种多糖的基团及振动类型基本相同，只是信号位置有所差别;1H-NMR结果表明PUP-1的单糖组成为α-吡喃半乳糖，β-吡喃葡萄糖，β-吡喃岩藻糖，PUP-2的单糖组成为α-吡喃半乳糖，β-吡喃葡萄糖，β-吡喃岩藻糖，β-吡喃甘露糖;对糖肽键的链接方式的研究结果表明，PUP-1、PUP-2与蛋白质的链接方式为O-连接，但不确定是否含N-连接;PUP-1的相邻单糖基连接方式为1→或1→6，1→2，1→4及1→3且摩尔比约为1∶6.37∶0.14∶8.57，PUP-2的连接方式为1→或1→6，1→2，1→4及1→3且摩尔比约为1∶5.02∶0.49∶12.33;碘-碘化钾试验表明三种多糖均有较多的分支及较长的侧链;刚果红试验及固态结构特征的测定结果表明，PUP-1表面较为光滑，分子间相互作用较强，在水溶液中呈现三股螺旋构象，PUP-2表面较为粗糙，分子间相互作用较弱，在水溶液中呈现单股螺旋构象。
　　三种多糖均有一定的抗氧化活性，即对超氧阴离子自由基、羟基自由基、有机自由基有一定的清除能力以及对Fe2+有一定的络合作用，纯化多糖能力优于粗多糖，但均弱于Vc，硫酸根含量相对较高的PUP-2比PUP-1具有更高的活性，PUP-2的最大清除率和螯合率分别为24.13％，55.94％，34.93％，16.31％;此外，降血糖试验结果与抗氧化结果相一致，即纯化多糖对α—淀粉酶抑制活性、α—葡萄糖苷酶抑制活性、对葡萄糖的吸收能力以及胆汁酸阻滞指数均高于粗多糖，且PUP-2比PUP-1效果更好。因此，PUP-2在药理价值方面具有潜在的开发前景。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1 目的意义

1．2 海藻多糖国内外研究进展

1．2．1 海藻多糖简介

1．2．2 海藻多糖的提取

1．2．3 海藻多糖的分离纯化

1．2．4 海藻多糖的结构分析

1．2．5 海藻多糖的生物活性

1．3 裙带菜国内外研究现状

1．3．1 裙带菜概况

1．3．2 裙带菜多糖的化学成分

1．3．3．裙带菜多糖的药理作用

1．4 存在的主要问题

1．5 本研究的主要内容

2 试验材料与方法

2．2 主要试剂与仪器

2．3 裙带菜多糖的提取纯化

2．3．1 裙带菜粗多糖的提取及除蛋白次数的条件优化

2．3．2 裙带菜多糖的DEAE Sepharose FF层析柱纯化

2．3．3 裙带菜多糖的纯度鉴定

2．4 裙带菜多糖理化性质的研究

2．4．1 裙带菜多糖的一般理化性质

2．4．2 HPGPC法测定分子量

2．4．3 总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸根含量的测定

2．5 裙带菜多糖的化学结构分析

2．5．1 HPLC法测定单糖组成

2．5．2 红外光谱分析

2．5．3 核磁共振分析

2．5．4 糖肽键链接方式的分析

2．5．5 相邻单糖基连接方式分析

2．5．6 碘-碘化钾试验

2．5．7 刚果红试验

2．5．8 固态结构特征的测定

2．6 裙带菜多糖的体外抗氧化活性研究

2．6．1 裙带菜多糖清除超氧阴离子自由基能力的测定

2．6．2 裙带菜多糖清除羟基自由基能力的测定

2．6．3 裙带菜多糖对有机自由基的清除作用的测定

2．6．4 裙带菜多糖对Fe2+的络合作用的测定

2．7 裙带菜多糖的体外降血糖活性研究

2．7．3 裙带菜多糖葡萄糖吸收能力的测定

2．7．4 裙带菜多糖胆汁酸阻滞指数的测定

3 试验结果与讨论

3．1 裙带菜多糖的提取纯化

3．1．1 裙带菜粗多糖的提取及除蛋白次数的条件优化

3．1．2 裙带菜多糖的DEAE Sepharose FF层析柱纯化

3．1．3 裙带菜多糖的纯度鉴定

3．2 裙带菜多糖理化性质的分析

3．2．1 裙带菜多糖的一般理化性质

3．2．2 HPGPC法测定分子量结果

3．2．3 总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸根含量的测定

3．3 裙带菜多糖化学结构的分析

3．3．1 裙带菜多糖单糖组成的分析

3．3．2 红外光谱分析

3．3．3 核磁共振分析

3．3．4 糖肽键链接方式的分析

3．3．5 相邻单糖基连接方式分析

3．3．6 碘-碘化钾试验

3．3．7 刚果红试验

3．3．8 固态结构特征的测定

3．4 裙带菜多糖体外抗氧化活性的研究

3．4．1 裙带菜多糖清除超氧阴离子自由基能力的测定

3．4．2 裙带菜多糖清除羟基自由基能力的测定

3．4．3 裙带菜多糖对有机自由基的清除作用的测定

3．4．4 裙带菜多糖对Fe2+的络合作用的测定

3．5 裙带菜多糖体外降血糖活性的研究

3．5．2 裙带菜多糖抑制α—葡萄糖苷酶活性能力的测定

3．5．3 裙带菜多糖葡萄糖吸收能力的测定

3．5．4 裙带菜多糖胆汁酸阻滞指数的测定

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

作者简介

致谢