小麦抗叶锈病相关基因TaGSO1的克隆及功能研究

摘要

小麦叶锈病是由叶锈菌侵染引起的真菌性气传病害，严重危害小麦生长。深入分析小麦抵抗叶锈菌侵染的分子机制、筛选抗病基因、培育抗病小麦新品种是防治小麦叶锈病最有效的途径。富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白(LRR-RLPs)是一类缺少胞质激酶结构域的细胞表面识别受体，涉及植物的生长和发育以及抗病性。本试验通过RNA-Seq高通量数据库筛选得到一个接种叶锈菌后较0h转录水平持续上调的基因CL13020.Contig2_All，通过RACE技术在TcLr26中获得该基因全长，构建系统进化树将其命名为TaGSO1。以小麦TcLr26/Tc与叶锈菌生理小种260分别构成不亲和和亲和组合，探讨TaGSO1基因在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中的功能，通过VIGS和RNAi技术初步证实TaGSO1基因在小麦抵抗叶锈病过程中起到了正调控作用，所得结果如下:
　　1.运用RACE技术从TcLr26中扩增得到TaGSO1基因全长2598bp，编码866个氨基酸，其蛋白结构包含7个LRRs结构域和1个跨膜区，属于典型的LRR-RLPs受体蛋白。蛋白质分子量为96.56KDa，等电点为5.95，属于结构稳定的非脂溶性的疏水性蛋白。
　　2.通过RT-qPCR技术分析TaGSO1基因在不同组合中表达差异。结果表明，在不亲和组合中，TaGSO1基因在8h具有较高水平的表达，随后下降，在16h恢复0h水平，而24h其表达量再次上升直到48h达到峰值水平。而在亲和组合中，TaGSO1基因表达量很低，并且随着侵染时间的延长表达量几乎没有变化。这一表达模式与该基因在数据库中的表达趋势基本一致。所以，推测TaGSO1基因参与了小麦抵抗叶锈菌的侵染过程。
　　3.利用VIGS和RNAi技术，降低小麦TcLr26中TaGSO1基因的表达量，接种叶锈菌生理小种260后，对50个单侵染点进行统计，结果显示与对照组相比，试验组HR面积明显增大，HMC数量增多。初步证明了TaGSO1基因在小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的HR反应中起到了正调控作用。
　　4.构建TaGSO1基因的亚细胞定位载体，发现TaGSO1蛋白在叶绿体中表达。
　　5.外源喷施SA后，与对照组相比，TaGSO1基因的表达在2h处急剧上升并达到峰值水平，随后表达水平持续下降，8h恢复至处理前水平，12h时其表达量再次上升并在16h达到第二高峰，然后开始下降。说明了TaGSO1基因的表达受外源SA的调控，TaGSO1基因可能介导了SA防卫信号传导途径。
　　6.预注射EGTA后接种叶锈菌生理小种260，TaGSO1基因的转录水平被强烈的抑制，表达量几乎为零。这一结果与受钙离子调控的基因差异表达数据库结果一致，表明TaGSO1基因参与了Ca2+信号通路。
　　7.近等基因系小麦接种叶锈菌生理小种260后，通过RT-qPCR检测TaGSO1基因的表达水平，证明在小麦与叶锈菌互作过程中，TaGSO1基因不仅参与基础防卫反应，还参与了不同Lr基因介导的防卫反应，且在不同Lr基因背景下发挥的作用有可能不同。

目录

声明

摘要

1．1小麦叶锈菌的危害

1．2植物抗病机制的研究

1．3超敏反应

1．4富含亮氨酸序列的类受体蛋白

1．5类受体蛋白激酶GASSHO

1．6本研究的目的及意义

2．1．1试验所用小麦与叶锈菌

2．1．2试验主要仪器

2．1．3试剂耗材

2．1．4试验使用的培养基及药品配制

2．1．5试验所用引物

2．2试验方法

2．2．2 CL13020．Contig2_All基因在小麦与叶锈菌互作过程中的转录分析

2．2．3 CL13020．Contig2_All基因的扩增与鉴定

2．2．4 CL13020．Contig2_All基因的生物信息学分析及构建进化树

2．2．5 VIGS载体的构建及转染小麦

2．2．6基因沉默效率检测及功能分析

2．2．7 RNAi载体的构建

2．2．8利用农杆菌介导的幼穗法进行RNAi载体的遗传转化

2．2．9 T1代RNAi阳性植株的鉴定及功能分析

2．2．10亚细胞载体的构建及瞬时转化烟草

2．2．11外源喷施水杨酸后TaGSO1基因相对表达量变化

2．2．13 TaGSO1在不同近等基因系小麦品种与叶锈菌互作过程中的转录分析

3结果与分析

3．3 CL13020．ContiG2_All基因全长的获得及生物信息学分析

3．3．1通过5'-RACE PCR获得基因cDNA序列全长

3．3．2 CL13020．ContiG2_All基因的生物信息学分析

3．4 VIGS技术研究TaGSO1基因功能

3．4．1 VIGS载体构建和体外转录

3．4．2 TaGS0I基因沉默效率的检测

3．4．3沉默TaGSO1基因后对HR及叶锈菌发育的影响

3．5 RNAi载体的构建及转基因小麦的获得

3．5．1 RNAi载体的构建

3．5．2 PCR检测阳性植株

3．5．3阳性植株沉默效率检测

3．5．4利用RNAi沉默TaGSO1基因对HR和叶锈菌生长发育的影响

3．6 TaGSO1的亚细胞定位

3．6．1 TaGSO1基因的亚细胞定位载体的构建

3．6．2 TaGSO1．GFP蛋白的荧光观察

3．7外源喷施SA对TaGSO1基因表达的影响

3．8预注射EGTA对TaGSO1基因表达量的影响

3．9不同近等基因系与叶锈菌互作过程中TaGSO1基因表达水平检测

4讨论

4．2 TaGSO1基因在小麦与叶锈菌互作过程中的作用

4．3进一步思考

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢