鉴别猪流行性腹泻强弱毒株TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法的建立

摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PED virus，PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高死亡率为特征的一种高度接触性肠道传染病。2010年以来，我国多地暴发的由变异毒株引起的PED，给养猪场造成了巨大经济损失。以CV777减毒株为代表的活疫苗在临床应用较为普遍，导致实验室诊断中无法快速区分野毒株与疫苗株。ORF3基因是PEDV的辅助基因，其部分片段的缺失可导致PEDV毒力减弱，也是鉴别PEDV强、弱毒株的重要靶标。本研究以ORF3为靶标，旨在建立鉴别PEDV强、弱毒株的TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan FQ-PCR)方法，为PED的诊断与防治提供重要技术支持。
　　分别以PEDV CV777减毒株和变异强毒株(HBQY)的核酸序列为模板，应用RT-PCR技术扩增PEDV ORF3全基因序列，回收的目的片段分别与pET-28a载体连接，构建了重组质粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3。应用PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ核酸内切酶消化以及序列分析对构建的重组质粒进行鉴定，证明构建的两个重组质粒内含有变异强毒株和减毒株的ORF3全基因。
　　根据CV777减毒株和强毒株ORF3基因序列的差异，设计一条鉴别强弱毒株的TaqMan探针引物及一对特异性PCR用引物，以重组质粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3为模板，通过优化反应条件，确立反应体系，建立了相应的标准曲线，获得了特异检测PEDV强毒株的Real-time PCR标准曲线和直线回归方程，而不能检测到PEDV减毒株核酸。对扩增的核酸片段进行序列测定，结果扩增片段与已知序列完全一致。建立的TaqMan FQ-PCR方法最低能检测到3.7拷贝的病毒核酸以及7.96个TCID50的病毒，与猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒等无交叉反应。当扩增阈值(Cq值)＜36时，结果判定为阳性;若Cq≥36，则判定为阴性，批间重复性试验的变异系数小于2.46％。进一步应用建立的TaqMan FQ-PCR检测了38份腹泻仔猪的小肠及其内容物、肠系膜淋巴结等样品，同时将待检样品接种到Vero细胞上，连续盲传3代后，用间接免疫荧光方法(IFA)检测PEDV。结果TaqMan FQ-PCR与IFA的PEDV阳性检出率分别为31.58％(12/38)和26.32％(10/38)，表明前者的敏感性高于后者。上述结果表明，基于PEDV ORF3基因建立的TaqMan FQ-PCR能够特异、敏感地快速鉴别检测PEDV强毒株，可以为PED的快速检测与防治提供重要技术手段。

目录

声明

摘要

缩略词表

1引言

1．1国内外研究进展

1．1．1病原

1．1．2流行病学

1．1．3临床症状与病理变化

1．1．4实验室诊断

1．1．5疫苗的研究进展

1．1．6防治

1．2研究目的与意义

1．3研究内容与技术路线

1．3．1研究内容

1．3．2技术路线

1．4研究目标

2．1．1毒株

2．1．2主要试剂及试剂盒

2．1．3主要仪器设备

2．2方法

2．2．1 PCR用引物的设计和合成

2．2．2 ORF3全基因的PCR扩增

2．2．3 PCR产物的纯化回收

2．2．4 ORF3基因的克隆与鉴定

2．2．5阳性标准品的制备

2．2．6反应条件的优化

2．2．7标准曲线的建立

2．2．8特异性检测

2．2．9判定标准的确定

2．2．10敏感性测定

2．2．11敏感性比较

2．2．12重复性检测

2．2．13临床应用

3．1重组质粒

3．2反应条件

3．2．1引物和探针浓度

3．2．2读板时间

3．2．3退火温度

3．3 TaqMan标准曲线

3．4特异性与阴阳性临界值

3．5敏感性

3．6敏感性比较

3．7重复性

3．8临床应用

4讨论

4．2实时荧光定量PCR技术的应用

4．3 TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

5结论

参考文献

作者简介

在读期间发表的学术论文

致谢

附录