茄链格孢无性产孢相关基因wetA功能的研究

摘要

由茄链格孢(Alternaria solani)引起的马铃薯早疫病是我国马铃薯生产中重要的病害之一，常造成大面积减产，给马铃薯生产带来巨大的经济损失。无性孢子是早疫病菌最常见的传播和侵染方式，探索早疫病菌分生孢子形成调控途径中关键基因的功能，对了解早疫病菌无性产孢机制以及寻找病害防治新靶标有着至关重要的作用。早期研究显示，wetA基因在丝状真菌无性产孢中心调控通路具有重要的调控作用。本文通过融合PCR、PEG介导的原生质体转化等方法构建了茄链格孢无性产孢相关基因wetA的缺失突变体，并研究了wetA基因的功能，主要研究结果如下:
　　1.wetA基因的生物信息学分析:利用特异性引物从茄链格孢的基因组中克隆得到了全长为1647bp的wetA基因，分析表明该基因不含内含子，编码548个氨基酸。通过NCBI下载不同丝状真菌中wetA的氨基酸序列，经过比对发现wetA氨基酸序列后半段是高度保守的区域，其中，A.alternata和A.solani同源性最高，达到92.34％。通过构建不同丝状真菌中wetA的系统发育树，发现茄链格孢中的wetA基因和A.alternata wetA基因亲缘关系最近。
　　2.wetA基因缺失突变体的构建:通过融合PCR技术，构建得到了wetA同源重组载体A+H+M（同源左臂，潮霉素磷酸转移酶基因和同源右臂），并通过PEG介导的原生质体转化法将同源重组载体转化原生质体，获得了缺失wetA基因的转化子。通过普通PCR和Southern杂交技术对wetA基因缺失突变体进行了验证，确认潮霉素磷酸转移酶基因为单拷贝插入，靶标基因wetA被潮霉素磷酸转移酶基因正确替换。
　　3.wetA基因功能的研究:在分生孢子的产生、萌发、形态以及致病力等方面比较分析了wetA基因缺失突变体与野生菌株间的差异。结果发现，ΔwetA突变体的单位面积产孢量为8.51×102个/cm2，野生菌株单位面积产孢量为1.32×103个/cm2，与野生型相比，ΔwetA突变体单位面积产孢量明显下降;在分生孢子萌发过程中，野生菌株与ΔwetA突变体分生孢子萌发率没有明显变化，培养2h后萌发率分别为98.67％、97.33％;经热胁迫处理后，野生型与ΔwetA突变体分生孢子萌发率均有所下降，培养2h后野生菌株的分生孢子萌发率为40.67％，ΔwetA突变体分生孢子萌发率为27.33％，且芽管萌发速度减慢;ΔwetA突变体分生孢子壁C1层压缩程度明显降低，细胞壁结构松散;在野生型和ΔwetA突变体分生孢子的致病力研究中，ΔwetA突变体侵染马铃薯叶片的能力较野生菌株减弱，但是并未完全丧失致病力。在菌丝形态、生长速度及穿透力等方面比较分析了wetA基因缺失突变体与野生菌株间的差异。结果表明，ΔwetA突变体菌丝较直，分枝减少;培养5d后ΔwetA突变体菌落直径为6.20cm，而野生菌株菌落直径仅为4.85cm，ΔwetA突变体菌丝生长速度加快，且穿透玻璃纸能力增强。

目录

声明

摘要

1引言

1．1丝状真菌无性产孢通路的研究

1．1．1丝状真菌分生孢子形成的上游激活因子

1．1．2丝状真菌分生孢子形成的中心调控基因

1．1．3丝状真菌分生孢子形成的修饰调节因子

1．2融合PCR技术

1．3丝状真菌遗传转化体系的发展与现状

1．3．1 LiAc转化方法

1．3．2基因枪法

1．3．3根癌农杆菌介导的遗传转化体系

1．3．4 REMI转化

1．3．5电击转化

1．3．6 PEG介导的原生质体转化

1．4本研究意义

2．1．1菌株与质粒

2．1．2供试仪器

2．1．3供试酶和主要试剂

2．1．4供试培养基

2．1．5供试引物

2．2茄链格孢基因组DNA提取

2．3茄链格孢RNA提取及cDNA的合成

2．4．1 wetA基因的扩增

2．4．2 PCR产物的纯化

2．4．4 wetA基因的生物信息学分析

2．5靶标基因同源重组片段的构建

2．5．1质粒的提取

2．5．2潮霉素磷酸转移酶基因及靶标基因上下游片段的扩增

2．5．3第一轮PCR产物的纯化

2．5．4融合PCR(自我延伸步骤)

2．5．5融合PCR全长的扩增

2．5．6靶标基因同源重组片段PCR产物的纯化

2．5．7靶标基因同源重组片段的克隆及测序

2．6茄链格孢原生质体制备与转化

2．6．1原生质体的制备

2．6．2 PEG介导的原生质体转化

2．7．2 ΔwetA突变体的Southem杂交检测

2．8 ΔwetA突变株的生物学功能研究

2．8．6 ΔwetA突变体分生孢子的胁迫耐受性

2．8．7分生孢子透射电镜样品的制备与观察

2．8．8 ΔwetA突变体的致病性检测

2．9数据统计与分析

3结果与分析

3．2 wetA基因的生物信息学分析

3．3缺失wetA基因突变体的获得

3．3．2 ΔwetA突变体的验证

3．3．3 ΔwetA突变体的Southem杂交验证

3．4 wetA基因的生物学功能研究

3．4．3ΔwetA突变体的体外穿透力增强

3．4．5 wetA影响分生孢子对热胁迫的耐受性

3．4．6 wetA修饰分生孢子壁的完整性

3．4．7 ΔwetA突变体对马铃薯的致病力减弱

4讨论

4．3缺失wetA基因的茄链格孢致病力减弱

5结论

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢