丙酸菌—大肠杆菌穿梭载体构建及表达

摘要

丙酸菌是一类厌氧异养革兰氏阳性菌,在其生长期间可产生丙酸故命名为丙酸菌。从来源分类为皮肤类与乳品类,乳品类丙酸菌,最初用于乳制品如奶酪的发香作用,具有广泛的益生菌活性,后又发现这类丙酸菌还能够在细胞内积累维生素B12,因此也是目前工业化生产维生素B12的主要菌株,此外这类丙酸菌还应用于发酵丙酸、杆菌素和四吡咯化合物。
　　 国外已经开展了对丙酸菌的分子生物学研究,国内研究未见报道,为了提高谢氏丙酸菌(Propionibacteria.shermanii)的维生素B12产量,本研究以谢氏丙酸菌WT为宿主研究材料,首次建立了分子操作的基本实验技术,主要结论如下:
　　 1、构建了丙酸菌(Propionibacteria.shermanii)-大肠杆菌(Escherichia.coli)之间的穿梭表达载体pTD-PcsAF。本实验将大肠杆菌克隆载体T-PcsAF的PcsAF启动子序列,通过酶切连接的方式插入到启动子捕获载体pTD210上,构建了谢氏丙酸菌(P.shermanii)-大肠杆菌(Ecoli)穿梭表达载体pTD-PcsAF。此载体能够在丙酸菌WT和大肠杆菌DH5α中进行复制表达。
　　 2、建立并优化了了适宜丙酸菌菌株WT的转化条件,使转化效率稳定且有提高。以重组载体pTD-PcsAF为质粒DNA进行转化条件研究,最佳转化条件为:在丙酸菌WT生长对数中期,即OD600达到1.0时制备感受态细胞;利用10%甘油作为洗涤缓冲液洗涤细胞;电转条件为场强度为1.0kV/cm,电阻为250Ω,电容为25μF;质粒DNA浓度为1μg/μL;电击后丙酸菌复原时间为20h时,具有较好的转化效率。
　　 3、将来自类球红假单胞菌(Rhodobactersphaeroides)的ALA合成酶基因插入到所构建的穿梭载体pTD-PcsAF上,构建了表达载体pTD-HemA,并转化至丙酸菌中WT中,对获得的突变株提取RNA,进行RT-PCR,证实HemA基因在菌株pTD-HemA中已进行了表达。但突变株ALA含量较野生型未有显著提高。