细胞色素b6f复合体中Chlα光保护机制研究

摘要

光合膜蛋白细胞色素b6f复合体（Cytochrome b6f complex，简称Cyt b6f)是光合电子传递链中三个重要的膜蛋白复合体之一，位于光系统Ⅱ和系统Ⅰ之间，介导两个光系统之间的电子传递，同时作为质子泵跨膜转运质子，为ATP合成提供能量。Cyt b6f除了4个大亚基和4个小亚基的蛋白组分之外，每个单体还结合1分子的叶绿素 a（chlorophyll a，Chl a）和1分子的类胡萝卜素(carotenoid，car)。研究表明，复合体中Chla在光照条件下非常稳定，其单线激发态（singlet excited state，1Chl a*）寿命很短，仅为～200 ps，荧光产率为～1.8％;而在甲醇中1Chl a*寿命为5～6 ns，荧光产率为20％～30％。推测该Chl a光稳定的原因是Cyt b6f特殊的蛋白环境快速猝灭了*Chl a，使Chl a荧光产率随之降低，最终导致Chl a三线态(triplet excited state，3Chl a*)和随后的单线态氧（1O2*）产率降低，但是目前对这一推测尚缺乏有力的实验证据。
　　根据Cyt b6f2.7(A)分辨率的晶体结构[1]，Chl a处于精细蛋白环境中，其中心Mg离子和H2O分子配位，并且该H2O通过氢键与复合体亚基Ⅳ的氨基酸G136和T137相互作用。本研究基于这一结构，1）以集胞藻6803(synechocystis sp.PCC6803)为材料，利用分子生物学手段，对Cyt b6f亚基Ⅳ的G136、T137氨基酸定点突变;2）运用生化手段分离纯化Cyt b6f蛋白制剂;3）研究野生和突变Cyt b6f蛋白制剂在强光条件下稳定性的差异;结合时间分辨光谱（Time resolved spectrometry，TRS）技术比较不同样品中Chl a荧光寿命的的差异。研究结果如下:
　　1)获得了3株集胞藻6803 Cyt b6f氨基酸定点突变株，即2个单突G136A和T137A，1个双突G136A/T137A;
　　2)以野生和突变菌株为材料，分离纯化了野生和3个突变Cyt b6f蛋白样品;
　　3)通过对野生和突变样品的光破坏实验，发现突变不仅导致蛋白与Chla结合能力下降，而且显著降低了Chl a的光稳定性。在强光照条件下，Cyt b6f中Chl a稳定性由高到低顺序为:野生＞单突T137A＞单突G136A＞双突G136A/T137A。TRS实验表明，野生Cyt b6f样品中Chl a的荧光寿命为～240 ps，与文献报道吻合;而双突G136A/T137A中，Chl a荧光寿命延长到～470 ps。
　　上述结果表明在Cyt b6f中，Chla所处的精细的蛋白环境，特别是复合体亚基Ⅳ的氨基酸G136和T137与Chl a形成的氢键网络对其稳定性具有重要的作用。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 Cyt b6?的组成及结构

1．1．2 光合作用中Chl α分子与光保护机制

1．1．3 Cyt b6?中Chl α分子光保护机制的研究进展

1．1．4 本研究对Cyt b6?中Chl α分子光保护机制的提出

1．2 本课题的研究内容与意义

1．2．1 研究内容

1．2．2 研究意义

第2章 集胞藻6803 petBD必需基因定点突变株的构建

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 实验材料与培养条件

2．2．2 试剂与工具酶

2．2．3 培养基和常用溶液配制

2．2．4 实验用到的仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 同源重组载体的构建

2．3．2 定点突变体系

2．3．3 定点突变体系扩增条件

2．3．4 质粒的提取与浓缩

2．3．5 集胞藻6803的自然转化方法

2．3．6 突变株的鉴定

2．3．7 突变株的纯化、保存及扩大培养

2．4 结果

2．4．1 同源重组载体pUC-petBD的构建

2．4．2 定点突变质粒的构建

2．4．3 集胞藻6803的转化和Kanr突变株的筛选

2．4．4 定点突变株株的验证

2．5 讨论

2．6 本章小结

第3章 集胞藻6803中Cyt b6?的分离纯化

3．1 引言

3．2 材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 所用溶液的配制

3．2．4 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1．集胞藻6803Cyt b6?蛋白样品的制备

3．3．2 Cyt b6?样品的SDS-PAGE分析

3．3．3 Cyt b6?样品的吸收全谱

3．4 结果与分析

3．4．1 野生集胞藻6803Cyt b6?样品的提纯

3．4．2 集胞藻6803突变体Cyt b6?样品的提纯

3．5 讨论

3．5．1 去垢剂在膜蛋白分离纯化中的重要作用

3．5．2 传统的分离纯化方法的运用

3．5．3 疏水层析与离子交换层析交互运用

3．5．4 蔗糖密度梯度离心

3．6 本章小结

第4章 氨基酸定点突变对Cyt b6?蛋白复合体中Chl α光稳定性的影响

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 吸收光谱的测定

4．3．2 Chl α的光破坏处理

4．3．3 时间分辨荧光光谱的测定

4．4 结果

4．4．1 Cyt b6?制剂的吸收光谱

4．4．2 Chl α光破坏的研究

4．4．3 时间分辨荧光光谱

4．5 讨论

4．6 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的论文

致谢