胶体金免疫层析法联合检测EV71和CA16IgM的研究

摘要

背景： 手足口病(Hand foot and mouth disease，HFMD)的主要致病原为肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie A16，CA16)。近年来，HFMD发病率在全球呈逐年上升趋势，引起全球特别是我国政府和医疗体系的高度关注。但临床缺乏早期快速简便高灵敏度的诊断方法，不能及时有效诊断疾病，常造成重大疫情，严重影响了人民健康和社会稳定。所以，寻找简便快速的床旁快速检测是目前手足口病防控研究的热点与难点。 目的： 建立胶体金免疫层析捕获法联合检测EV71和CA16 IgM试纸条。 方法： 1.EV71-VP1重组蛋白的表达优化:将pET-41b(+)-VP1转入BL21(DE3)中，制备重组菌。初步诱导表达后，经SDS-PAGE和Western blot检测，当结果与预期结果一致时，采用单因素变量法分别进行诱导时间、诱导剂浓度的优化，选择最适条件进行诱导表达。 2.EV71-VP1重组蛋白的纯化:表达产物通过Streamline DEAE和StreamlineChelating进行纯化获得高纯度蛋白。 3.试纸条的初步制备与检测:以实验室同类试纸条制备方法制备试纸条并检测。试纸条以EV71-VP1和CA16-VP1抗原分别作检测线1、检测线2，以羊抗鼠IgG多克隆抗体作质控线，胶体金标记鼠抗人IgMμ链抗体。 4.工艺优化:通过对胶体金粒径、标记pH、蛋白标记量、蛋白包被量、胶体金保护液配方、加入量和硝酸纤维素膜的优化选择，从而对试纸条的性能进行优化。 5.对试纸条性能进行评价:从试纸条的特异性、灵敏度、精密性、稳定性、重复性对试纸条性能进行评价。 结果： 1.高效表达并纯化获得EV71-VP1抗原:通过优化实验确定BL21(DE3)/EV71-VP1的最适诱导剂浓度和诱导时间;SDS-PAGE检测重组蛋白表观分子量为30KDa～40KDa; Western blot检测证实重组抗原具有较好的特异性和良好的抗原性;纯化复性后获得蛋白量21.6 mg，纯度达96.5％。 2.初步制备了胶体金免疫层析捕获法联合检测EV71和CA16 IgM试纸条。确定EV71-VP1抗原和CA16-VP1抗原的最适包被浓度，标记抗体浓度。灵敏度、特异性、精密性、重复性好。37℃放置5周试纸条性能稳定。 结论： 1.经原核表达和纯化成功获得了重组蛋白EV71-VP1，并制备用于检测早期EV71和CA16感染的胶体金免疫层析试纸条; 2.建立了采用双波长扫描检测胶体金稳定性选择标记pH的方法。

目录

声明

摘要

第一部分 前言

1．1 分子生物学特性

1．2 流行病学

1．3 防治手段

1．4 实验室诊断

1．5 本课题的目的、意义及创新性

第二部分 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

第三部分 实验结果

3．1 初步诱导表达

3．2 Western blot鉴定

3．3 诱导条件的优化

3．4 重组蛋白的诱导表达和纯化

3．5 复性后蛋白量的测定与抗原保存

3．6 胶体金颗粒大小的选择

3．7 生物投射电子显微镜检测结果

3．8 最佳标记pH优化

3．9 最佳标记蛋白量的优化

3．10 免疫金的鉴定

3．11 金标保护液的优化

3．12 最佳金标保护液加入量优化

3．13 硝酸纤维素膜优化

3．14 检测线抗原包被浓度的选择

3．15 试纸条检测结果的判定

3．16 试纸条灵敏性实验

3．17 试纸条特异性检测结果

3．18 试纸条精密性实验

3．19 试纸条重复性实验

3．20 试纸条稳定性实验

第四部分 讨论

4．1 检测抗原的选择

4．2 胶体金检测技术的特点

4．3 胶体金试纸条的性能优化

4．4 标记pH的优化

4．5 金标保护液组份的优化选择

4．6 未来的工作

第五部分 小结

参考文献

文献综述 肠道病毒71型和柯萨奇A组16型检测研究进展

附录 符号与缩略语

攻读学位期间发表文章情况

致谢

个人简历