高蛋氨酸饮食对大鼠主动脉平滑肌细胞CCL5和CCR5表达的影响及机制

摘要

背景：
　　动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是目前发病率逐年攀升的心血管疾病至关重要的病理基础，已成为一些发达国家和我国主要的死亡原因，严重危害着人们的健康。近年来，血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平被视为导致AS的一个新提出的、关键地非传统危险因素，日趋受到人们关注，但其具体致病机制还不清楚。因此，深入探讨长期高蛋氨酸（DL-Methionine，Met,又称甲硫氨酸）饮食引发的高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)所导致AS的机制，可以为将来临床上通过降低血浆Hcy水平来治疗AS提供理论依据和新的治疗思路。
　　目的：
　　观察长期高蛋氨酸饮食能否引起HHcy，而HHcy能否通过核转录因子-κB(NF-κB)传导通路诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞表达CC趋化因子配体5(CC chemokine ligand5，CCL5)及其受体CCR5(chemoattractant cytokines receptor5)的变化，探讨HHcy与AS的相关性及其致病机制。并观察叶酸联合VitB12用药和瑞舒伐他汀对高蛋氨酸饮食引起AS的治疗效果，为临床干预提供理论依据。
　　方法：
　　清洁级、健康、8周龄SD雄性大鼠40只，体重180～220g，适应性喂养7天后被随机分为4组:正常对照组（10只）、高蛋氨酸(Met)饮食组（10只）、叶酸联合VitB12治疗组（10只）和瑞舒伐他汀治疗组（10只）。正常对照组喂食基础饲料;高蛋氨酸饮食组喂食的基础饲料中增加1.7％的蛋氨酸;瑞舒伐他汀治疗组应用高蛋氨酸饮食组饲料喂食4周后加用每日5mg/kg瑞舒伐他汀灌胃;叶酸联合VitB12治疗组应用高蛋氨酸饮食组饲料喂食4周后加用每日3mg/kg叶酸和15ug/kg VitB12灌胃。
　　各组SD大鼠均按实验设计分别喂养至实验12周末，以酶法（一步终点比色法）检验各组大鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)浓度;用高效液相色谱方法检验每组大鼠血浆Hcy水平;观察苏木素伊红染色、油红“O”染色后胸主动脉在光镜下的病理学改变，并观察电子显微镜下其超微结构变化;通过免疫组化方法检测各组大鼠主动脉平滑肌细胞中趋化因子CCL5及受体CCR5的蛋白表达情况;免疫组化染色后，使用实时逆转录-聚合酶链反应检验各组大鼠动脉平滑肌细胞中CCL5、CCR5、核转录因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的mRNA表达。
　　结果：
　　1.血脂浓度每组大鼠的血浆总胆固醇浓度、甘油三脂浓度均无明显差异(P＞0.05)。
　　2.血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度高蛋氨酸饮食组血浆Hcy含量(80.79±23.86mmol/L)明显高于正常对照组(9.47±4.55 mmol/L，P＜0.05)和治疗组(53.97±12.24 mmol/L，37.88±4.84mmol/L，P＜0.05)。两治疗组中，叶酸联合VitB12治疗组血浆Hcy值(37.88±4.84mmol/L)显著低于瑞舒伐他汀治疗组(53.97±12.24 mmol/L，P＜0.05)。
　　3.大鼠胸主动脉的病理改变①HE染色（光镜下观察）:正常对照组胸主动脉表现为内皮细胞连续且规整，内弹力膜基本完整，中膜平滑肌细胞无增生且排列整齐。高蛋氨酸(Met)饮食组大鼠胸主动脉的变化为其内膜损伤，内皮细胞坏死、脱落，中膜平滑肌细胞疏松、紊乱，内膜下有泡沫细胞形成。叶酸联合VitB12组和瑞舒伐他汀组主动脉壁病理形态学变化介于正常对照组和高Met饮食组之间;②油红“O”染色（光镜下观察）:正常对照组、叶酸联合VitB12组和瑞舒伐他汀组胸主动脉在油红“O”染色之后无明显差别，未染色。高Met饮食组局部主要表现为内膜下红染;③超微结构观察（电子显微镜下）:高Met饮食组表现为胸主动脉内膜局部损伤，可见内皮细胞内空泡增多。平滑肌细胞排列紊乱，线粒体明显水肿，并可见较多中膜平滑肌细胞由收缩型向合成型转变。正常对照组的血管内皮细胞及平滑肌细胞没有上述改变。瑞舒伐他汀组与叶酸联合VitB12组病变介于高Met饮食组与正常对照组之间。
　　4.免疫组织化学染色血管平滑肌细胞中CCL5和CCR5蛋白的阳性表达为粗细不均匀的棕黄色颗粒，局限于细胞质内。CCL5蛋白在高Met饮食组（139.50±15.40）的表达较强，显著高于正常对照组（112.25±10.75，P＜0.05）和两治疗组(114.05±10.90，125.89±11.89，P＜0.05)，其在叶酸联合VitB12治疗组（125.89±11.89）的表达高于瑞舒伐他汀治疗组(114.05±10.90，P＜0.05)。CCR5蛋白在高Met饮食组（139.12±7.71）表达较强，明显强于正常对照组（125.41±9.93，P＜0.05）和两个治疗组（121.11±9.15，130.59±8.29，P＜0.05），在治疗组中又以叶酸联合VitB12治疗组（130.59±8.29）表达较高，强于瑞舒伐他汀治疗组(121.11±9.15，P＜0.05)。
　　5.RT-PCR CCL5 mRNA在高Met饮食组（0.93±0.02）表达高于正常对照组（0.45±0.00，P＜0.05）和治疗组(0.69±0.01，0.87±0.00，P＜0.05)，在叶酸联合VitB12组（0.87±0.00）中的表达高于瑞舒伐他汀组(0.69±0.01，P＜0.05)。CCR5 rnRNA在高Met饮食组（1.97±0.36）表达较强，明显高于正常对照组（1.02±0.04，P＜0.05）和两个治疗组（1.12±0.23，1.53±0.41，P＜0.05），在叶酸联合VitB12治疗组（1.53±0.41）中的表达高于瑞舒伐他汀治疗组（1.12±0.23，P＜0.05）。NF-κB P56在高Met饮食组（2.16±0.43）表达较强，明显高于正常对照组（1.35±0.06，P＜0.05）和两个治疗组（1.39±0.18，1.73±0.26，P＜0.05），在叶酸联合VitB12治疗组(1.73±0.26）中的表达高于瑞舒伐他汀治疗组(1.39±0.18，P＜0.05)。
　　结论：
　　1.HHcy可能通过NF-κB传导通路使动脉壁平滑肌细胞表达较高水平的趋化因子CCL5及其受体CCR5，促进AS的发生发展。
　　2.瑞舒伐他汀和叶酸联合VitB12均能减轻HHcy所致的AS病变，但在抑制趋化因子生成方面瑞舒伐他汀优于叶酸联合VitB12。

目录

声明

摘要

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

综述

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢

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