基于1HNMR的代谢组学技术在移植供肝质量和功能评估中的临床实验研究

摘要

目的：
　　本研究拟以核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance，1HNMR)代谢组学技术为基础，在临床实际中建立移植肝脏保存模型，对移植肝脏低温保存中不同时间节点的代谢组进行研究，分析在低温保存中的代谢变化，建立以核磁共振氢谱(1Hnuclear magnetic resonance，1HNMR)代谢组学在移植供肝质量和功能评估中新方法。
　　方法：
　　(1)随机选取40例低温保存移植肝脏，供体年龄控制在50岁以内，性别随机分配。根据离体肝脏保存的不同时间（基点0h、4h、8h、12h）每例取保存液2ml，每个时间点10例样本，收集到的UW液应自门静脉原位灌注后，至肝脏颜色变为土黄色，从上下腔静脉和下下腔静脉流出收集，收集后立即放置液氮中保存以备使用。首先对采集到样本制备，然后使用Varian UNITY INOVA600 MHz超导脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪采集保存液样本和组织提取物的核磁共振数据(NMR)。NMR图谱是由自由感应衰减(free induction decay，FID)信号经超导脉冲傅立叶转换而来，最后所有的数据输出并保存，用于模式识别分析。把保存的数据先由Pareto标度化(Pareto scaling)和平均中心化(mean centering)进行预处理，再由SIMCA-P12.0软件(v12.0，Umetrics，Ume，Sweden)将得到的数据采用主成分分析法(principalcomponent analysis，PCA)分析，为强化组间差异，进一步采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)或正交信号校正(OSC)分析。以得分图(scores plot)和因子载荷图(loadings plot)的形式表示分析结果。四组保存液样本代谢物的归一化积分值采用统计学SPSS17.0对单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
　　(2)建立以1HNMR代谢组学技术为基础的肝脏保存液代谢组学平台，探讨1HNMR技术在移植肝脏保存中功能评估和质量评估应用的可行性，并通过UW液的在不同时期的代谢变化，同时找出引起这些差异变化的主要代谢物，作为潜在的标志物。
　　结果：
　　1、1H-NMR谱图中可以看出，UW保存液中棉子糖(Raffinose)、腺苷(Adenosine)、柠檬酸盐（Citrate）、琥珀酸盐(Sueeinate)、乙酸（Ethanol）、肌酸/肌酐(creatine/creatinine)、次黄苷(Inosine)、乳酸（Lactate）丙氨酸、等代谢物的含量在不同时期发生了变化，而次黄嘌呤(Allopurinol)、谷胱甘肽(Glutathione)、胆碱(Choline)、等代谢物则变化不明显。
　　2、对0h、4h、8h、12h混合组先进行了PCA和OPLS-DA分析。其中0h灌注的UW液样本有明显的聚集情况，而4h、8h及12h明显的与0h分开，且较为分散，从PCA载荷图是可以看出明显的差别的，说明随着保存时间的延长，各组都发生了明显的代谢变化，是但4h、8h、12h样本之间的氢谱图之间存在一定重叠。
　　3、在4h与8h、4h与12h以及8h与12h之间进行了PCA和OPLS-DA模式识别分析，各组之间代谢差异明显，特别是显现在OPLS-DA模式识别分析。找出每组之间差异明显的积分区段所对应的代谢物质，也是影响着移植供肝代谢变化明显的生物标志物。其中琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸、谷氨酰胺以及次黄苷，腺嘌呤、葡萄糖的代谢是引起4h、8h、12h组与基准点差异最大的代谢物。
　　结论：
　　1、基于1HNMR的UW液代谢组学研究方法可以通过研究正常组和保存组移植供肝UW液的小分子内源性代谢物的变化，找到能够实验中发现能够代表移植供肝质量用以评估的生物标志物:琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸、谷氨酰胺以及次黄苷等，为评价移植供肝质量评估提供新的思路和方法。
　　2、这些标志物与糖代谢的无氧酵解，三羧酸循环及腺嘌呤代谢密切相关，证实肝脏在人体的新陈代谢中重要的作用。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1 材料

1．1 移植肝脏供体

1．2 实验仪器和材料

2 实验方法

2．1 供体获取

2．2 低温保存

2．3 UW保存液样本的制备

2．4 核磁共振(HNMR)数据采集

2．5 核磁共振(HNMR)数据多元统计分析

结果

讨论

结论

参考文献

移植肝脏领域中1HNMR代谢组学技术应用

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢

个人简历