α-干扰素对神经细胞中p11、5-HTR1b和5-HTR4表达的影响

摘要

抑郁症是应用α-干扰素的一种重要副作用,但α-干扰素诱导抑郁症的分子机制还不清楚.一些研究表明5-HTR1b(5-羟色胺受体1b)和5-HTR4(5-羟色胺受体4)在p11(S100钙结合蛋白A10,S100A10)相关抗抑郁效应中发挥着重要作用,而且我们的前期研究发现α-干扰素能够下调p11水平.所以我们猜想α-干扰素诱导的抑郁可能是由p11和5-羟色胺受体介导的.为了发现这些分子在α-干扰素诱导抑郁中的功能,我们研究了α-干扰素(IFN-α)对人类神经母细胞瘤细胞(SH-sy5y)中5-HTR1b和5-HTR4表达的影响. 结果：发现对Balb/c小鼠腹腔注射IFN-α能够延长小鼠悬尾实验和强迫游泳实验的不动时间.IFN-α处理能够显著下调SH-sy5y细胞中5-HTR1b和5-HTR4的蛋白水平,而且这种改变呈现出时间和剂量依赖.通过过表达和沉默实验,我们揭示了5-HTR1b和5-HTR4是p11的下游效应蛋白.过表达p11有效逆转了IFN-α对5-HTR1b和5-HTR4的下调作用.这些结果表明IFN-α能够下调p11,进而下调5-HTR1b和5-HTR4.p11被认为是5-HTR1b和5-HTR4的一个有效调控因子,因此,p11可能作为IFN-α诱导抑郁症风险评估和疗效监测的一个潜在靶标. 目的：通过细胞实验和小鼠行为实验,研究IFN-α对p11、5-HTR1b和5-HTR4表达的影响,以及p11对5-HTR1b、5-HTR4表达的影响,从而阐述5-HTR1b、5-HTR4和p11参与IFN-α诱导抑郁的机制. 方法：1.动物和药物作用：实验用小鼠是成年雄性野生型Balb/c鼠.连续十天注射hIFN-α-2b(1000IU/g/天,腹腔注射,总体积<0.2mL),对照组小鼠是腹腔注射同等体积的PBS.小鼠注射时间是每天上午九点. 2.小鼠行为实验：把小鼠逐个轻柔放入一个玻璃缸中(高30cm,直径10cm),玻璃缸中盛有温度为24-26℃的水,水深18cm,游泳6分钟.累计第2-6分钟内的不动时间以分析行为.通过远端尾部(1-1.5cm)将小鼠悬挂在一个平坦的金属表面上,使其悬挂点距离地面40cm.记录第2-6min的不动时间,作为抑郁样行为的一个指标. 3.细胞培养：人神经母瘤细胞系培养在含有10%胎牛血清的DMEM中,并含有50U/mL青霉素,50mg/mL链霉素,37℃,含有5%CO2.所有实验都是在细胞融合率达到80%-90%时进行的. 4.hIFN-?-2b处理：细胞剂量依赖实验,用一系列浓度(0,50,500,1000,2000,and3000IU/mL)的hIFN-α-2b处理.细胞时间依赖实验,作用时间依次为0,6,12,24,36,和48小时,用单一浓度即1000IU/mL的hIFN-α-2b处理. 5.质粒构建：构建过表达p11的质粒p11cDNA3.0和使p11沉默的质粒p11-SiRNA. 6.质粒转染：用转染试剂脂质体2000(Invitrogen,USA)转染质粒.转染的质粒包括p11-pcDNA3.0,pcDNA3.0(对照),p11-SiRNA,and SiRNA-control(对照).在转染后的第5小时,用PBS清洗细胞,然后继续用完全DMEM培养. 7.胞膜(cytomembrane)蛋白抽提：用Mem-PER真核生物膜蛋白提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific,美国).用抗管蛋白(Tublin)抗体(Abcam,USA)检测胞膜蛋白的纯净度. 8.Western blot：Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测p11、5-HTR1b、5-HTR4的蛋白水平 9.RNA抽提：用RNA提取试剂盒(Minico,USA)提取总RNA. 10.RT-PCR.使用SuperscriptⅢ逆转录试剂盒(Invitrogen,USA).通过RT-PCR检测cDNA. 11.统计分析所有实验非参数未配对T检验的P值都是由Prism软件计算的(GraphPad Software Inc.)..F检验用来比较差异.我们认为P值<0.05具有显著性：*,P<0.05;**,P<0.01. 结果：1.应用IFN-α使小鼠悬尾实验和强迫游泳实验的不动时间延长. 2.IFN-α能够显著下调SH-sy5y细胞中5-HT1Rb、5-HTR4的蛋白水平,且呈时间和剂量依赖. 3.IFN-α能够下调SH-sy5y细胞胞膜上p11、5-HTR1b和5-HTR4的蛋白水平. 4.过表达p11有效逆转了IFN-α引起的5-HTR1b和5-HTR4下调. 结论：p11通过影响5-HTR1b/4的蛋白水平参与α-干扰素诱导的精神抑郁.

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