黄芪多糖对脂肪组织中巨噬细胞活化的影响机制

摘要

背景：胰岛素抵抗(insulin resistance IR)是多种疾病的共同发病机制，也是一种炎症状态。脂肪组织中巨噬细胞(adipokse tissue macrophages ATMs)在IR中有重要作用。近年研究显示，黄芪多糖（astragalus polysaccharide APS）能改善IR，但其机制尚不完全明确。我们的前期研究发现APS在改善IR的同时，能减少ATMs的数量。而且ATMs数量的减少将减轻脂肪组织低度炎症的程度、减少致炎性脂肪细胞因子的产生、改善IR。ATMs已经成为治疗IR的新靶点。通过查阅文献，尚未见有APS对ATMs影响的相关报道。那么APS减少ATMs的作用是通过影响脂肪细胞？还是直接作用于巨噬细胞？以及通过何种机制减少了ATMs?这些问题尚不明确，需进一步探索。
　　目的：探讨APS对ATMs的影响机制。明确APS的作用位点是通过影响脂肪细胞，还是直接作用于巨噬细胞;通过观察致炎因子的表达来探讨APS的干预对巨噬细胞活化的影响。
　　方法：(1)细胞培养:脂肪细胞采用3T3-L1细胞株，巨噬细胞采用ANA-1细胞株。将3T3-L1前体脂肪细胞接种于培养板内，用含10％小牛血清的高糖DMEM培养在37℃、5％CO2培养;待细胞长满至80-90％，融合2天后，加含终浓度0.5mmol/L IBMX、1umol/LDEX和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10％小牛血清高糖DMEM培养48h;48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10％小牛血清高糖DMEM再培养48h;48h后再换含10％小牛血清的高糖DMEM继续培养;以后每2天更换含10％小牛血清的高糖DMEM培养液一次。诱导分化8至12天，90％的3T3-L1细胞呈成熟脂肪细胞，用油红O鉴定后用于实验。
　　(2)本研究采用对照设计。实验分三组:空白对照组(NC)，APS干预脂肪细胞组(AF)，APS干预巨噬细胞组(AM)，每组培养8个复孔。将成熟脂肪细胞低于90％者剔除出组，最后每组选择6个复孔做对照试验。通过Transwell共培养方式，将巨噬细胞种于上室内，将脂肪细胞种在下室内，采用孔径0.4um的膜。脂肪细胞3T3-L1分化成熟后，将0.100g/L的APS分别加入脂肪细胞培养液和巨噬细胞培养液作为干预因素，对照组细胞培养液不加APS;48小时后取出小室，去除培养液，加入细胞裂解液，收集细胞裂解液后采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)的表达。实验结束时采用酶联免疫试剂法(ELISA)检测各组上下小室培养液中IL-6、TNF-α等细胞因子的表达。
　　(3)实验结果的统计学分析采用SPSS13.0软件进行，以均数±标准差((x)±s)表示实验结果。采用t检验，检验水平采用0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：(1)ELISA检测结果显示:①IL-6: AF组下室与NC组下室比较，p＜0.05，差异有统计学意义。AF组上室与NC组上室、AM组上室与NC组上室、AM组下室与NC组下室比较，p＞0.05，差异均无统计学意义。②TNF-α: AF组下室与NC组下室比较，p＜0.05，差异有统计学意义。AF组上室与NC组上室、AM组上室与NC组上室、AM组下室与NC组下室比较，p＞0.05，差异均无统计学意义。
　　(2)RT-PCR检测结果显示:NC组上室iNOS出现高表达，AF组上室与AM组上室iNOS表达量均降低，但AF组上室表达量更低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：1.APS减少ATMs的作用位点是脂肪细胞。
　　2.APS可抑制脂肪细胞释放炎性因子，进而减少巨噬细胞的活化。

目录

声明

摘要

前言

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 实验仪器

1．1．2 试剂药品

1．1．3 脂肪细胞3T3-L1及ANA-1巨噬细胞来源

1．2 技术路线图

1．3 实验方法

1．3．1 细胞培养方法

1．3．2 实验分组

1．3．3 实验过程

1．4 实验结果

1．4．1 酶联免疫吸附法测定IL-6水平

1．4．3 RT-PCR检测

1．5 统计学处理

2 结果

2．1 细胞培养情况观察

2．3 ELISA结果

3 讨论

4．结论

5．小结

参考文献

综述

附录

攻读学位期间发表文章及获奖情况

致谢

个人简历