腺苷预处理星形胶质细胞氧糖剥夺复氧糖后CX3CL1、GLT-1表达的研究

摘要

目的:
　　通过体外分离、纯化及鉴定SD大鼠来源的星形胶质细胞(Astrocyte As)的方法，建立氧糖剥夺/复氧糖模型，探讨缺氧复氧情况下，腺苷预处理诱导趋化因子(CX3CL1)、星形胶质细胞谷氨酸转运体蛋白(GLT-1)的表达情况，为临床治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。
　　方法:
　　1.体外培养SD大鼠星形胶质细胞，根据星形胶质细胞在皮层分布的特点，取出生24h内的SD大鼠，剥离其脑膜和血管，通过机械吹打法和差速贴壁的发法处理及进行细胞传代。用倒置显微镜观察细胞的形态学改变。
　　2.对培养至第三代或第四代的星形胶质细胞通过免疫荧光法行胶质纤维酸性蛋白酶GFAP的鉴定。
　　3.在24孔板内，将融合80％以上的第三代星形胶质细胞进行传代，随机分为正常组、模型组(OGD/R)及腺苷预处理组(ADO/R)。24h后细胞基本贴壁，且伸出突触，贴壁后ADO/R组给予腺苷预处理，即用含100μM腺苷的DMEM预先处理细胞，24h后进行氧糖剥夺过程。正常组不进行此过程，OGD/R组和ADO/R组在糖氧剥夺期均更换为无糖DMEM培养基，把培养板盖去掉，放入缺氧培养箱（含95％氮气、5％CO2）的中孵育。缺氧进行5h后，OGD/R组和ADO/R组均更换为复耱DMEM培养基，移入正常细胞培养箱(含37℃、5％CO2)内继续培养24h。正常组细胞在正常培养箱（含37℃、5％CO2）中孵育。用光学显微镜观察各组细胞氧糖剥夺复氧糖后的形态学变化。
　　4.在96孔板内，以1×105个/mL的密度接种第3代星形胶质细胞，每孔为104个细胞数，待24h后细胞融合后，经过氧糖剥夺处理后，用MTT法检测各组细胞的活力。
　　5.在24孔板中接种上对数期生长的星形胶质细胞，细胞融合后，弃掉培养液，然后随机分组，各组细胞经氧糖剥夺处理后，在相应的各孔中加入1000μL培养基，在复氧复糖24h后，将各组细胞上清液收集出来，按照大鼠CX3CL1 ELISA试剂盒测定CX3CL1浓度。在450nm波长下，用酶标仪测定吸光度OD值，根据标准曲线计算样品大鼠CX3CL1的浓度。
　　6.用免疫荧光法检测各组GLT-1的表达情况。
　　7.用Western blot的方法测GLT-1的表达水平。将各组氧糖剥夺复氧糖后的细胞进行消化，在加蛋白裂解液，冰上裂解20分钟，蛋白浓度测定后在加上样缓冲液，经过沸水变性5分钟，在每孔中加40ug蛋白样品进行电泳，用PVDH膜转膜，封闭以后经1∶500的稀释比例加入一抗，在4度冰箱过夜后，加HRP标记的二抗，37度孵育箱内孵育1h，经ECL显影后，用GAPDH做内参进行对照，各组荧光条带的吸光度值用ImageJ软件分析。统计学分析目的蛋白GLT-1与内参的比值。
　　8.数据结果用均数土标准差((x)±s)来表示，用Spss17.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差进行分析，用Turkey法行两两比较，采用a=0.05的检验水准。
　　结果:
　　1.成功培养原代星形胶质细胞。
　　2.氧糖剥夺5h复氧糖24h后星形胶质细胞的形态学改变:正常组星形胶质细胞氧糖剥夺复氧糖241h后生长状态良好，与之前相比无明显的形态学改变;OGD/R组星形胶质细胞胞体因水肿变圆，形状由不规则形变为梭形，突起明显变短或消失;ADO/R组细胞有较轻的水肿改变。
　　3.MXT法细胞活性检测表明:经氧糖剥夺复氧糖24h后，OGD/R组细胞活性明显下降;与正常组相比，OD值降低(P＜0.05)，说明细胞的活力下降是由细胞损伤或死亡引起的。较OGD/R组，ADO/R组细胞活力较高，说明细胞活力受ADO影响(P＜0.05)。且两两比较有显著的统计学差异(P＜0.05)。
　　4.细胞培养液中CX3CL1的测定结果显示:氧糖剥夺复氧糖24h后细胞培养液中CX3CL1浓度测定表明，OGD/R组星形胶质细胞CX3CL1浓度显著高于正常组(P＜0.05)，表明细胞缺氧缺糖损伤严重，释放出大量的CX3CL1;ADO/R组与OGD/R组相比，CX3CL1浓度明显降低(P＜0.05)，表明细胞损伤较OGD/R组轻，CX3CL1的释放量较少。比较细胞培养液中CX3CL1浓度，三组间两两比较有显著的统计学差异(P＜0.05)。
　　5.GLT-1免疫荧光结果显示:正常组的胞膜与胞质中荧光信号表达最强;经氧糖剥夺复糖氧后，OGD/R组胞膜荧光信号表达减弱;而胞质中荧光强度表达弱且无显著的变化。与OGD/R组相比，ADO/R组胞膜荧光强度降低但显著高于OGD/R组。
　　6.Westernblot检测氧糖剥夺/复糖后GLT-1的表达情况显示:正常组星形胶质细胞在氧糖剥夺5h/复氧糖24h后GLT-1蛋白表达相对最高，ADO/R组次之，OGD/R组最低，三组间两两比较有显著的统计学差异(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.星形胶质细胞在氧糖剥夺复氧糖后受损严重;
　　2.星形胶质细胞的损伤程度与其活性、CX3CL1的表达浓度呈对应变化的关系;
　　3.腺苷预处理可减少氧糖剥夺复氧糖后星形胶质细胞的损伤程度，并使氧糖剥夺/复氧糖后谷氨酸转运体蛋白GLT-1的表达水平升高，从而增强了大脑对缺血再灌注损伤的耐受程度。

目录

声明

摘要

前言

1．实验材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

附图

参考文献

综述

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢

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