BMSCs经STAT3和NF-κB通路诱导Wistar大鼠肝RFA炎症反应中M2极化的研究

摘要

射频热消融术（Radiofrequency thermal ablation,RFA）作为局灶性原发性/继发性肝细胞癌最常用的治疗方法，已纳入标准化临床实践操作[1]。RFA是小肝癌可完全治愈的方法之一。随着RFA基础的研究进展，适应症逐步拓展，中、晚期肝癌（尤其直径≥3cm）行RFA治疗后，其热效应引起的炎症反应可促进残余肿瘤复发[2]、转移[3,4,5,6]。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可诱导巨噬细胞M2型极化[7,8,9]，通过调节炎症介质释放，进而减弱坏死灶周围组织炎症反应[10]，最终减少RFA治疗肝癌术后复发、转移。 目的：通过提取Wistar大鼠BMSCs及其肝RFA术后（Postoperative RFA,Post-RFA）肝巨噬细胞（Macrophage,M(O)），BMSCs通过共培养经STAT3和NF-κB通路诱导肝巨噬细胞M2极化，进而调节炎症介质的释放，减轻炎症反应。 方法：1.通过密度梯度离心法联合贴壁法分别提取正常大鼠BMSCs，利用流式细胞仪检测抗原表型，给予成骨诱导并鉴定。 2.随机将36只Wistar大鼠分为6组（①RFA对照组、②Post-RFA12h组、③Post-RFA24h组、④Post-RFA72h组、⑤Post-RFA120h组、⑥Post-RFA168h组）建立肝RFA损伤炎症模型，利用组织免疫荧光评价M2聚集表达量最高的时间点； 3.通过密度梯度离心法联合贴壁法分别提取正常组M(O)及Post-RFA-M(O)，利用Transwell小室及划痕实验检测细胞迁移能力，CD163免疫荧光染色标记M2-M(O)表达情况。 4.体外BMSCs和肝巨噬细胞Transwell共培养分为6组（对照组A组：PBS和D组：BMSCs；巨噬细胞对照组B组：M(O)和C组：Post-RFA-M(O)；实验组E组：BMSCs+M(O)和F组：BMSCs+Post-RFA-M(O)），24h后ELISA检测上清中IL-10、TNF-α；定量RT-PCR测M(O)中IL-10、TNF-α基因；48h后固定M(O)，CD163免疫荧光检测和流式细胞检测；MTT法检测M(O)的增殖情况；Transwell小室单个培养M(O)，检测BMSCs分泌因子对M(O)迁移能力的影响；实验组加入STAT3抑制剂S3I-201，共培养48h后，提M(O)总蛋白后，用Western blot法测NF-κB p65/NF-κB p-p65、JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3。 结果：1.顺利从健康Wistar大鼠胫骨骨髓中分离出生长旺盛并可持续传代培养的BMSCs。 2.30只Wistar大鼠成功建造成肝损伤炎症模型，24h HE染色肝内可见成纤维细胞、中性粒细胞浸润，72h免疫荧光偶见巨噬细胞聚集，168h时M2型表达量与前五组相比明显增多，差异有统计学意义。 3.分别成功从RFA对照组和Post-RFA168h组提取巨噬细胞，并通过划痕和Transwell小室实验鉴定其迁移能力，发现在48h时迁移能力最强，免疫荧光CD163鉴定发现Post-RFA168hM2型阳性率达42%。 4.BMSCs和M?共培养后，通过ELISA检测和定量RT-PCR检测显示F组中的IL-10明显升高、TNF-α明显减低；免疫荧光和流式细胞结果显示F组CD163阳性率较高，同时MTT检测发现BMSCs有明显促M(O)增殖作用；Transwell小室结果显示E组和F组M(O)迁移能力增强；Western blot结果显示BMSC抑制M(O)表面NF-κB p65表达，同时，促进p-JAK1和p-STAT3表达，给予STAT3抑制剂后，BMSCs诱导p-STAT3表达明显降低。 结论：BMSCs具有促进Post-RFA-M(O)增殖和迁移作用，并且能调节炎症介质分泌；BMSCs能通过NF-κB和STAT3信号通路诱导RFA术后M(O)多表达为抗炎促修复的M2型。

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