IL-18过表达对人结直肠癌HCT-116细胞增殖的影响及诱导奥沙利铂原发耐药机制的探究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 过表达IL-18抑制人结肠癌细胞HCT-116的增殖 背景： 近年来，细胞因子介导的治疗已成为抗肿瘤治疗的重要研究方向。细胞因子是一类具有激活或者抑制免疫系统活性的免疫调控蛋白，其生物学功能的发挥常与其自身属性以及作用浓度、发挥作用的环境等相关。一些细胞因子，如IL-2、TNF、IFN-α等，已得到广泛的研究并尝试用于某些种类肿瘤的治疗。IL-18已经被多项体外和小鼠体内研究以及小规模临床研究证明在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。然而,对于IL-18在肿瘤发生发展过程中所发挥的确切作用是存在争议的。 目的： 研究IL-18基因过表达对人结肠癌HCT-116细胞体内外增殖的影响。 方法： 1.构建含人IL-18基因片段的载体。 2.采用慢病毒转染法获得稳定过表达人IL-18基因的HCT-116细胞株。 3.在倒置荧光显微镜及成像系统下观察慢病毒转染效率，并用Western Blot法检测转染后细胞内IL-18蛋白的表达。 4. CCK-8法检测转基因组细胞HCT-116-IL-18与转空载体组细胞mock HCT-116的增殖。 5. Western Blot法检测两组细胞内IL-18、Cyclin D1、增殖细胞核抗原（PCNA）、蛋白的表达。 6.将mock HCT-116、HCT-116-IL-18细胞分别接种于裸鼠左右两侧腋下，观察其成瘤性及移植瘤的生长情况. 7.用免疫组织化学法检测裸鼠异种移植瘤组织中IL-18及PCNA的表达。 结果： 1. IL-18基因在 HCT-116细胞内过表达可以抑制HCT-116细胞的增殖（P＜0.05）。 2.与对照组（转入空载体组）HCT-116细胞相比，实验组（转入IL-18基因组） HCT-116-IL-18细胞中 PCNA、Cyclin D1表达下调（P＜0.01）。 3. HCT-116-IL-18细胞在裸鼠体内成瘤率明显降低，其成瘤率为43%，而空载体组细胞成瘤率为100%。与对照组相比，实验组成瘤时间晚、生长慢且瘤体小。 4.免疫组化结果显示，与mock HCT-116细胞组相比，HCT-116-IL-18细胞组裸鼠移植瘤组织中IL-18表达上调， PCNA表达下调（P＜0.01）。 结论： IL-18基因过表达对 HCT-116细胞生长增殖具有抑制作用，这可能与IL-18抑制细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达有关。 第二部分 IL-18诱导奥沙利铂原发耐药机制的探究 背景： 奥沙利铂是一种非肾毒性的第三代铂络合物，相对于二代铂类化疗药物而言，它以较强的抗肿瘤活性，和较小的血液学毒性优势被广泛应用于临床抗肿瘤治疗，常与其他药物联合广泛用于胃癌、结直肠癌等患者的化疗。近年来，也有大量研究表明，细胞因子 IL-18有较强的抗肿瘤的生物学活性。本课题组前期研究发现，IL-18在结肠癌 HCT-116细胞中发挥着重要的抗肿瘤生长及增殖的作用，其作用机制可能是通过抑制细胞周期 G1期的关键蛋白Cyclin D1的表达来抑制肿瘤细胞的增殖。但我们意外发现过表达IL-18可以上调PARP的表达，而PARP表达上调意味着DNA修复能力的增加，从而降低药物对DNA损伤作用。本实验通过研究过表达IL-18对奥沙利铂的杀伤敏感性的影响，为个体化用药及治疗提供前期科研依据。其对奥沙利铂敏感性的影响可能是因为其影响了干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes， STING）的表达。据大量研究表明，STING有较强的抗肿瘤发生发展的作用。近年来，在胞质 DNA传感领域对 STING进行了大量研究，现在被公认为先天免疫信号的关键介体。来自体内小鼠模型的大量证据表STING调节通路是许多疾病（包括传染病和癌症）的发病机制的基础，STING有可能成为抗肿瘤治疗的新靶点。 目的： 研究过表达IL-18基因的HCT-116细胞与空载体组细胞相比，对奥沙利铂敏感性差异及可能的分子机制。 方法： 1. CCK-8法检测空载体组细胞（对照组）与HCT-116-IL-18细胞（实验组）对不同浓度OXA的敏感性。 2.用含有OXA浓度为10μg/ml的DMEM完全培养液培养两组细胞，并用Western blot法检测干扰素刺激基因（stimulator of interferon genes，STING）、TBK-1、IRF3、IL-18和PARP蛋白的表达。 3.两组细胞用10μg/ml OXA进行杀伤作用后，流式细胞法检测两组细胞的周期和凋亡变化情况。 4.在HCT-116细胞中瞬时转染下调STING表达的质粒，用含有不浓度OXA的培养液对m-STING/HCT-116和空载体组细胞进行杀伤，CCK-8法检测细胞生存率差异。 结果： 1.在相同浓度的OXA作用下，与空载体组细胞相较，HCT-116-IL-18细胞死亡率下降. 2.与空载体组细胞相比较，HCT-116-IL-18细胞中STING、TBK-1、IRF3、表达减少，IL-18、PARP表达增多，两组细胞均给予相同浓度的奥沙利铂进行杀伤后，PARP、STING、TBK-1、IRF3表达均上调。 3. IL-18基因过表达对HCT-116细胞的周期无明显影响，在给予10μg/ml OXA培养液培养48h后，与对照组相比较，G2期细胞减少，实验组S期细胞明显增多， G1期细胞所占百分比无明显变化. 4.在10μg/ml OXA作用48h后，实验组凋亡明显少于低于对照组。 5.下调 HCT-116细胞中STING基因表达后，其对奥沙利铂的敏感性降低。 结论： 过表达IL-18可以降低HCT-116细胞对OXA的敏感性，其作用机制可能是IL-18基因过表达通过上调PARP从而抑制了STING基因的表达。

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