代谢型谷氨酸受体在低氧诱导的颈动脉体可塑性中的作用

摘要

背景： 阻塞型睡眠呼吸暂停患者在睡眠中反复出现上气道阻塞，引起循环间歇性低氧血症（CIH），继发高血压，部分归因于颈动脉体可塑性增强引起交感神经活性增加。谷氨酸是兴奋性神经递质，其受体分为离子型（Ionotropic glutamate receptor，iGluR）和代谢型受体（Metabotrapic glutamate receptor，mGluR）。我们前期研究发现，颈动脉体表达iGluR，CIH通过iGluR谷氨酸能信号通路调控颈动脉体可塑性。但是该通路并不能解释CIH引起的颈动脉体可塑性的全部现象。我们推测mGluR谷氨酸能信号通路参与调节CIH诱导的颈动脉体可塑性。 目的： 1.从分子生物学水平阐明颈动脉体表达mGluR； 2.从形态学水平明确mGluR1/5在颈动脉体的定位； 3.从功能学水平阐明低氧对颈动脉体mGluR1/5的调控。 方法： 1.采用RT-PCR技术检测人及大鼠颈动脉体代谢型谷氨酸受体mGluR各个亚基mRNA的表达。 2.运用免疫荧光双标染色技术，通过与颈动脉体Ⅰ型细胞标记物酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）和Ⅱ型细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫荧光共染，明确第Ⅰ组代谢型谷氨酸受体（mGluR1和mGluR5）在大鼠颈动脉体I型细胞和Ⅱ型细胞的定位；此外，通过与神经元和神经纤维标记物神经丝蛋白（Neurofilament，NF）共染，明确第Ⅰ组代谢型谷氨酸受体在神经元和神经纤维上的定位。 3.体外实验，通过培养颈动脉体，应用Western blot检测低氧对颈动脉体mGluR1/5信号通路的调控。 （1）在含正常氧浓度的条件下培养颈动脉体（21%O2-5%CO2），检测DHPG、JNJ16259685和MPEP对mGluR1/5信号通路的调控； （2）在低氧环境下培养颈动脉体（5%O2-5%CO2-90%N2），检测低氧刺激JNJ162599685和MPEP对mGluR1/5信号通路的影响。 4.通过CIH动物模型，模拟OSA患者睡眠CIH的病理过程，检测CIH对mGluR表达的调控：使用Biospherix Oxycycler A84，制备CIH模型，模型组大鼠暴露于CIH（10%O23min-21%O21min，10次/h，8h/d，14d），对照组饲养于常氧环境（21%O2）。 结果： 1.RT-PCR结果显示，大鼠及人颈动脉体表达多种代谢型谷氨酸受体亚基：（1）mGluR的8个亚型mRNA在大鼠颈动脉体上均表达；（2）人颈动脉体表达mGluR1、mGluR2、mGluR5、mGluR6、mGluR7、mGluR8的mRNA，但mGluR3和mGluR4在人颈动脉体未获得扩增条带。 2.免疫荧光结果显示：mGluR1在颈动脉体Ⅰ型细胞和神经元表达，但在Ⅱ型细胞和神经纤维不表达。mGluR5定位在颈动脉体Ⅰ型细胞、Ⅱ细胞、神经元和毛细血管内皮细胞表达，但不表达于神经纤维。 3.体外实验，我们发现： （1）mGluR1/5激动剂DHPG上调CaMKII和Akt的磷酸化水平，且该激活作用可被mGluR1特异性抑制剂JNJ16259685和mGluR5特异性抑制剂MPEP所抑制，说明颈动脉体存在功能性mGluR1/5，激活mGluR1/5后可触发其下游信号通路传导； （2）低氧上调Akt和ERK磷酸化水平，JNJ16259685可抑制低氧引起的Akt和ERK磷酸化升高，而MPEP无影响，说明mGluR1而不是mGluR5通过激活Akt和ERK介导的信号通路参与调节颈动脉体对低氧的反应； （3）低氧处理增加TH的表达水平，JNJ16259685对低氧引起的TH表达水平升高具有促进作用。然而，MPEP对低氧引起的TH表达水平增加具有明显抑制作用。说明在mGluR1/5与低氧引起的TH表达升高相关，且具有相反作用：mGluR1对TH的表达具有抑制作用，而mGluR5对TH的表达具有激活作用。 4.通过循环间歇性低氧动物模型，我们发现，给予大鼠14天循环间歇性低氧，上调mGluR5mRNA表达水平，而对mGluR1mRNA表达水平无影响。 结论： 1.大鼠及颈动脉体表达多种mGluR亚型mRNA； 2.mGluR1与mGluR5在颈动脉体的分布不一致：mGluR1定位于颈动脉体Ⅰ型细胞和神经元；mGluR5定位于Ⅰ型细胞、Ⅱ型细胞、神经元和毛细血管内皮细胞； 3.CIH通过上调mGluR5表达水平介导CIH诱导的颈动脉体可塑性； 4.mGluR1/5信号通路可能介导低氧诱导的颈动脉体可塑性。

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