一株产低温碱性蛋白酶海洋菌的筛选与发酵

摘要

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，该酶催化反应速度较快，无工业污染，被广泛地应用于皮革脱毛、饮品澄清、洗涤剂、化妆品以及医药治疗等行业。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用微生物发酵制备，目前工业生产所用菌株主要为霉菌、细菌及少数酵母、放线菌。海洋微生物具有独特的生理特征，如:耐盐、耐高压、嗜低温等，因此海洋微生物将成为获取新的生物活性物质的重要来源。所以从海洋微生物中筛选蛋白酶的新型高产菌种非常具有实际意义。
　　本文系统的介绍了一株新型蛋白酶菌株的筛选，鉴定，发酵条件优化，产物提纯，产物性质测定等实验过程并对其中遇到的问题进行了说明。菌种筛选的海水样品取自秦皇岛近海，经过初筛和复筛确定一株产蛋白酶能力最强的菌株，编号为D5。对D5进行16S rDNA测序分析及生理生化鉴定确定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)。而后进行了D5菌培养基的单因素试验，确定了较为适宜菌株产酶的碳源，氮源，无机盐的种类。最终确定培养基为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖5g/L、硝酸铵0.8g/L、三氯化铁0.2g/L、氯化锰0.2g/L、氯化镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L；发酵条件为：发酵温度30oC、发酵时间24小时，搅拌转速150r/min。在此条件下进行发酵发酵液酶活可达1140U/ml。随后分别用盐析，层析等方法对发酵液中的蛋白酶进行了纯化。经过分离纯化，D5菌蛋白酶比活由初始的65.23U/mg提高到了441.87U/mg，提高了6.77倍，收率40.3％。对纯化产物的性质进行了研究，结果表明：D5菌所产蛋白酶为碱性蛋白酶，分子量约为26kDa，最适pH为9，最适温度为35oC，热稳定性差，根据抑制反应确定其应为一种丝氨酸蛋白酶。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 绪论

1.1 蛋白酶概述

1.2 微生物蛋白酶简介

1.3 海洋微生物概述

1.4 课题的提出及内容

第二章 产蛋白酶的海洋微生物的筛选与鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第三章 蛋白酶生产条件的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第四章 所产蛋白酶的纯化及性质研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 小结

第五章 结论

参考文献

攻读学位期间所取得的相关科研成果

致谢